Implications de la nouvelle technologie pour la pratique des maladies infectieuses

De nouveaux tests pour le diagnostic des maladies infectieuses – en particulier ceux qui utilisent des technologies moléculaires – vont révolutionner les pratiques de maladies infectieuses, mais les promesses ne se concrétiseront pas dans plusieurs années Les problèmes posés par les tests moléculaires actuellement disponibles comprennent un manque de connaissances sur l’acide nucléique microbien dans des hôtes «normaux», concentration de matériel d’agent dans de petits échantillons, manque d’expertise microbiologiste, manque de remboursement adéquat et difficulté de validation basée sur des méthodes conventionnelles. Les cliniciens doivent apprécier les lacunes de la nouvelle technologie pour l’utiliser de façon efficace et appropriée. réalisons des progrès tangibles dans notre capacité à détecter de nouveaux agents étiologiques; la disponibilité de tests de diagnostic rapides et précis pour les infections précédemment difficiles; et avance dans de nouveaux paradigmes basés sur la réponse humaine pour les tests de diagnostic

La promesse d’un appareil portatif de diagnostic des maladies infectieuses inspiré par Star Trek qui scanne le corps d’un patient et fournit immédiatement les informations nécessaires pour le diagnostic et le traitement est probablement dans des années. Jusqu’à ce que les cliniciens et les microbiologistes se retrouvent au chômage, nous pouvons Des technologies déjà disponibles Cet aperçu abordera une sélection de technologies et donnera un avis sur leur utilité, leurs pièges résumés dans le tableau, et leur potentiel. Bien que le jour où tous les laboratoires de microbiologie diagnostique utilisent couramment des outils moléculaires n’est pas encore arrivé , de nombreux cliniciens croient qu’une pléthore de tests de ce type est facilement disponible. Les laboratoires sont régulièrement invités à effectuer un test PCR pour détecter un agent que seules quelques études publiées ont rapporté, ces études ne décrivant généralement que des résultats préliminaires. le laboratoire ne peut pas fournir ce service

le personnel expérimenté actuel Trente-quatre pour cent des microbiologistes travaillant aujourd’hui sont & gt; ans ; La plupart d’entre eux prendront leur retraite dans les prochaines années. Leur compétence dans les méthodes moléculaires est minime. Cependant, ces microbiologistes expérimentés peuvent interpréter une coloration de Gram et fournir une estimation éclairée quant à l’identification d’un agent pathogène à un stade précoce. Les nouveaux stagiaires de laboratoire plus jeunes ne sont pas hautement qualifiés dans l’environnement conventionnel ou de haute technologie, et les microbiologistes en général sont en pénurie. Nous sommes confrontés à une et combler les lacunes au cours des prochaines années, au cours desquelles les outils moléculaires rempliront leurs promesses Même dans les laboratoires dotés de microbiologistes qualifiés pendant la journée, de nombreux résultats d’analyse critiques sont nécessaires pour les équipes de nuit et de nuit. dotés de laboratoriens non spécialisés En conséquence, les médecins auront moins de Dans les résultats des tests, il faudra prendre un plus grand nombre de décisions empiriques et utiliser un plus grand nombre d’agents antimicrobiens à large spectre Un autre aspect de la pénurie de technologues expérimentés est que les tests sont plus basés sur les instruments que sur les disciplines. migration des tests sérologiques de l’hépatite et du VIH des services de microbiologie ou de virologie vers le laboratoire d’immunochimie, où les généralistes ou les technologues en chimie effectuent ces tests ainsi que d’autres sérums, tels que les toxines et les protéines. Les testeurs ne connaissent généralement pas les agents. pour lesquels ils testent, ce qui pourrait conduire à des erreurs d’interprétation ou à des résultats inadéquats. Il est difficile, au mieux, de valider les résultats des tests assurant l’utilité clinique, la fiabilité et la reproductibilité des résultats à l’aide de nouvelles technologies. méthodes donnent souvent des résultats qui ne correspondent pas à la wer, des tests plus sensibles Trouver des critères cliniques ou des cibles moléculaires alternatives pour vérifier quel résultat est correct peut être fastidieux, coûteux et parfois impossible Obtenir des normes adéquates ou des échantillons positifs pour valider les résultats des tests et former des technologues performants est également un défi. des échantillons de liquide céphalo-rachidien pour la méningo-encéphalite du virus de l’herpès simplex; Les difficultés à trouver suffisamment d’échantillons et à créer des échantillons ensemencés avec des charges virales connues pour des études de validation ont empêché ou retardé le développement de cette méthode. En outre, des problèmes identiques ont entravé la soumission et l’approbation par la FDA des tests commerciaux du virus de l’herpès simplex. Certains kits de tests réactifs spécifiques à l’analyte sont disponibles pour le virus de l’herpès simplex et les entérovirus, mais ils La menace d’une pandémie de grippe aviaire peut aider à stimuler le développement de tests moléculaires multiplex pour les virus respiratoires L’utilisation de tests de laboratoire pour le diagnostic de la maladie du système nerveux central entéroviral s’est révélée rentable il y a longtemps . , mais la disponibilité des tests moléculaires rapides à cette fin a été dans de nombreuses circonstances, des tests que les médecins spécialistes des maladies infectieuses ont entendu, par exemple, lors de réunions nationales, comme celle de l’Infectious Diseases Society of America, seront disponibles uniquement comme tests d’envoi aux laboratoires de référence, accompagnés des problèmes de transport et de la dégradation possible des échantillons. , et les coûts Si un test moléculaire disponible n’est pas effectué dans le laboratoire local, l’un des avantages les plus importants – des résultats rapides – n’est pas réalisé, car l’échantillon doit être envoyé à un laboratoire de référence distant Même après la dernière génération de Les tests moléculaires, tels que le test GeneXpert pour les streptocoques du groupe B Cepheid, dont la clairance est modérément complexe, deviennent disponibles , leur coût initial peut retarder la mise en œuvre généralisée Il existe, bien entendu, des méthodes moléculaires très répandues, comme le VIH et amplification de l’acide nucléique Essais NAA pour Chlamydia trachomatis et N gonorrhoeae utilisant des échantillons génitaux ou spécimens d’urine ns Cependant, de nombreux médecins supposent que l’on peut facilement tester un prélèvement oculaire comme un prélèvement cervical, sans comprendre que le laboratoire doit effectuer une validation approfondie d’un échantillon non inclus dans l’autorisation initiale de l’appareil si un rapport De nombreux tests moléculaires sont limités aux laboratoires de référence ou aux enquêtes de recherche seulement. Bien sûr, toutes les nouvelles technologies ne sont pas basées sur les acides nucléiques, et je discuterai également d’autres méthodes.

Problèmes spécifiques aux tests de détection moléculaire disponibles

Pour les tests de maladies infectieuses après l’enlèvement de l’échantillon de Papanicolaou Malheureusement, contrairement aux examens visuels directs dans lesquels la qualité de l’échantillon peut être évaluée, un résultat négatif d’un tel test ne comprend aucun commentaire sur la qualité de l’échantillon. les échantillons de sang total pour la détection des agents de la septicémie ne sont pas encore disponibles, plusieurs tests sont en cours de développement Le volume sera un facteur de sensibilité de ces tests La quantité de bactéries dans le sang provenant d’un patient atteint de bactériémie est souvent & lt; cfu / mL , mais le volume utilisé dans la plupart des flacons de réaction NAA est & lt; μL Même si l’échantillon est concentré d’une manière ou d’une autre, le risque que le matériel génétique microbien atteigne le flacon de réaction peut être très faible, ce qui donne des résultats faussement négatifs dans les échantillons contenant des neutrophiles ou des érythrocytes humains. agent – il est difficile de concentrer l’ADN microbien sans ajouter aussi des quantités écrasantes d’ADN somatique humain, et les méthodes d’extraction et de filtration frontales disponibles, la capture de particules magnétiques et les systèmes à base de silice manquent toujours d’efficacité Les fabricants dépensent le plus de leur énergie sur la détection et le reporting de la technologie back-end Le traitement frontal est urgent, aboutissant idéalement au développement d’une nouvelle méthode créative pour concentrer les échantillons riches en cellules tels que le liquide purulent, le sang et les expectorations détection des acides nucléiques microbiensLe diagnostic de la méningite tuberculeuse est un autre exemple des problèmes inhérents Technologie des cations utilisant la PCR Les patients peuvent présenter des signes et des symptômes confondants, le nombre d’organismes dans l’échantillon du LCR peut être très faible et les tests conventionnels sont insensibles et / ou lents. Le volume de liquide céphalo-rachidien requis pour une culture adéquate est d’au moins mL, de préférence en mL, car Mycobacterium tuberculosis est extrêmement flottant dans le LCR en raison de sa paroi cellulaire cireuse; ainsi, la concentration par centrifugation est inefficace Les frottis pour les bacilles acido-résistants fabriqués à partir des sédiments doivent être étalés et examinés de manière exhaustive – parfois dans l’espoir de détecter la tige M tuberculosis rare NAA semblerait être la réponse. , Les tests NAA montrent une sensibilité globale de%,% -% et une spécificité de% range,% -%, tel que déterminé par une méta-analyse d’études publiées, dont ont utilisé des méthodes individuelles développées et validées en laboratoire. Lorsque les résultats des laboratoires utilisant des tests disponibles dans le commerce ont été évalués séparément, la sensibilité globale a été réduite à%,% -%. Ces tests sont susceptibles d’être disponibles pour la plupart des cliniciens. -les frottis de bacille rapide Les cliniciens doivent se rendre compte qu’une dépendance indésirable à une nouvelle technologie peut entraîner des erreurs diagnostiques. Une autre technologie hautement favorisée pour le diagnostic en laboratoire des maladies infectieuses, qu’il s’agisse de tester Sue directement ou testant des colonies isolées, est une identification par séquençage des acides nucléiques Il existe également des pièges dans cette approche Par exemple, de nombreux organismes, bien qu’ils puissent être antigéniquement ou biochimiquement distincts, sont génétiquement identiques. Des membres du groupe Bacteroides fragilis, par exemple, La plupart des cliniciens réalisent que les espèces d’Escherichia coli et de Shigella sont très apparentées , mais elles n’ont pas considéré la difficulté que poserait cette parenté si nous nous appuyions sur le séquençage pour identifier ces genres directement. Dans les échantillons de patients L’étendue des gènes partagés et des traits taxonomiquement ou phénotypiquement partagés entre la plupart des microbes est inconnue. Un autre problème que les cliniciens vexent est la confusion taxonomique causée par les investigations génétiques Rhinosporidium seeberi, par exemple, est un agent des lésions de masse dans les sinus et les muqueuses. l’organisme a souvent été observé dans histopatho mais il n’a jamais été cultivé en culture Il ressemble à la sphérule de Coccidioides immitis, cependant, il a longtemps été considéré comme un champignon « unculturable » Récemment, le séquençage de l’ARNr a placé l’organisme dans un groupe de parasites de poissons protozoaires Les nouveaux germes de Mycoplasma fermentans, initialement appelés Mycoplasma incognitus, ont été impliqués dans le syndrome de la guerre du Golfe avant d’être testés de manière plus approfondie. et l’infection par le VIH Il a été constaté plus tard être assez commun chez les humains Après un traitement efficace, les résultats de la PCR des échantillons génitaux obtenus de patients avec C trachomatis restent positifs pour & gt; semaines L’acide nucléique est détectable mais probablement pas viable Nous ne connaissons pas l’ampleur du transport de l’ADN microbien ou «normal» microbien non cultivable dans d’autres hôtes sains

Problèmes non techniques avec beaucoup de nouvelles technologies

Par exemple, la FDA a autorisé un test de PCR en temps réel pour la colonisation vaginale / rectale streptococcique du groupe B pendant le travail L’utilisation généralisée de ce test pourrait nier le coût de l’équipement, des réactifs coûteux et du personnel qualifié supplémentaire. la nécessité d’effectuer des cultures pour les femmes enceintes pendant les semaines de gestation, et il résoudrait les problèmes associés au traitement des femmes qui se présentent au travail sans résultats de dépistage Actuellement,% des femmes reçoivent de la pénicilline prophylactique pendant le travail si seules les femmes avec des résultats PCR positifs pour les streptocoques du groupe B au travail ont été traitées Le problème, cependant, est que les recommandations actuelles ont déjà réduit l’incidence des streptocoques du groupe B néonatale précoce à moins que l’objectif national de santé. de cas par naissances vivantes, et l’amélioration supplémentaire n’est pas rentable Lucile Packard Childrens Hôpital Johnson Center, une université de Stanford M Chaque année, pour effectuer le test de PCR immédiatement après la réception de chaque échantillon, il est nécessaire de s’assurer que la prophylaxie est administrée pendant au moins h avant la livraison. Nous devrons faire appel à un technicien en tout temps. Vingt-quatre à sept employés pour des jours par an nécessiteraient des scientifiques de laboratoire clinique, à un coût de main-d’œuvre et frais généraux de $, Les réactifs -notre compte du coût de l’instrument lui-même – coûte $, annuellement, pour un coût annuel total de $, Stanford University Medical Center Stanford, CA patients ont un taux de colonisation de% chez les femmes en travail, entraînant des bébés à risque par an prévenir les infections à streptocoques du groupe B en utilisant ce test, le coût par infection évitée serait $, Ceci est une vente difficile pour les administrateurs hospitaliers qui se concentrent sur le bas lin Les économies potentielles de main-d’œuvre du personnel de laboratoire grâce à l’utilisation de systèmes moléculaires modérément complexes à accès aléatoire, comme GeneXpert mentionné plus haut, peuvent contribuer à réduire les coûts ongle incarné, cassé ou retourné. Les coûts des nouvelles technologies sont souvent ajoutés aux tests existants. Le remboursement de Medicaid Services est en retard sur l’utilisation de nouveaux tests Dans la zone de remboursement du nord de la Californie, notre laboratoire ne reçoit que $ pour un test de PCR pour Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis, bien que cela coûte plus de $ les tests sont toujours effectués un échantillon à la fois, ce qui nécessite de tester simultanément des contrôles supplémentaires

Défis et réussites associés à l’amplification moléculaire et au séquençage

L’avenir n’est pas si sombre, bien sûr. De nouveaux agents de maladies importantes sont découverts grâce aux technologies moléculaires Parmi ceux qui ont récemment été élucidés, on peut citer Tropheryma whipplei, Bartonella henselae, Ehrlichia chaffeensis et Mycoplasma genitalium Défis liés aux maladies infectieuses sont prêts pour des solutions avec nos nouveaux outils moléculaires L’étiologie de% des cas de pharyngite est inconnue , et l’étiologie de% -% des cas de diarrhée est inconnue , tout comme l’étiologie de% -% des cas de pneumonie Nous ne pouvons pas cultiver ~% des organismes dans les crevasses sous-gingivales des patients atteints de maladie parodontale Tous ces mystères concernant les syndromes irritants finiront par céder aux technologies moléculaires

Technologie Microarray

La protéomique, c’est-à-dire le profilage des protéines générées par les cellules humaines en réponse à divers stimuli, y compris les composants et les produits d’agents infectieux, n’en est qu’à ses balbutiements, mais les développements excitants sont attrayants. avec des séquences d’acide nucléique dans l’échantillon, représentant des acides nucléiques trouvés à la fois dans la situation normale et dans l’état activé de transcription ou représentant diverses séquences génétiques uniques à une vaste gamme de microbes pour la détection d’agents infectieux ou ARN en petites séquences discrètes, pour lesquelles une séquence identique existe sur la puce Si l’échantillon d’acide nucléique trouve sa correspondance, il lie et émet un signal électronique Une telle puce peut être utilisée pour déterminer la réponse d’un patient à Traitements antimicrobiens toxiques avant l’accouchement Si le patient n’a pas d’enzymes capables de détruire les toxines ou de métaboliser efficacement un médicament, Les thérapies alternatives peuvent être utilisées pour éviter les effets indésirables dangereux Dans un autre test basé sur les puces à ADN, la réponse des leucocytes humains à divers agents infectieux peut être utilisée pour identifier l’étiologie avant que l’agent lui-même puisse être détecté. sur une voie rapide, pour faciliter la détection des agents de bioterrorisme avant la phase symptomatique de la maladie rend insuffisantes les mesures préventives répandues La protéomique est utilisée pour affiner le développement de nouveaux anti-infectieux Un aspect de la technologie des puces à ADN être normalisé et codifié est le problème monumental de l’analyse des données Une toute nouvelle discipline de la bioinformatique s’est développée à cette fin. Ce défi d’interprétation du vaste volume de données générées par les biopuces est acquis avec les avancées technologiques. En résumé, l’utilité potentielle future de ces Cependant, les lacunes de ces technologies doivent être reconnues. Les dangers actuels comprennent le manque de soutien pour le besoin de microbiologistes formés traditionnellement, l’allocation de l’expertise vers des sites éloignés des patients. les activités de soins, la confiance inappropriée envers les nouvelles technologies et la sous-estimation de la valeur du diagnostic clinique fondée sur le sens aigu des praticiens expérimentés et des praticiens des maladies infectieuses

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels EJB a été membre du bureau des conférenciers pour Becton Dickinson et Cepheid et a reçu du matériel de soutien à la recherche de la part de Cepheid, de Roche Molecular Diagnostics et d’AdvanDx