Révolution en cours en bactériologie: identification systématique des bactéries par spectrométrie de masse à temps de vol à ionisation et désorption laser assistée par matrice

Contexte La spectrométrie de masse MALDI-TOF identifie avec précision les bactéries et bactéries sélectionnées dans certaines situations cliniques. Elle n’a pas été évaluée pour une utilisation de routine dans la clinique. Méthodes Nous avons analysé prospectivement l’identification de la spectrométrie de masse MALDI-TOF de routine dans parallèles avec l’identification phénotypique conventionnelle des bactéries indépendamment du phylum ou de la source d’isolement Les discordances ont été résolues par l’ARN ribosomique S et l’identification moléculaire basée sur la séquence du gène rpo B Les colonies par isolat directement déposées sur la plaque MALDI-TOF ont été analysées. spectrométrie de masse Les spectres peptidiques ont été comparés à la base de données Bruker BioTyper, version, et le score d’identification a été noté. Les retards et coûts d’identification ont été mesurés Résultats des isolats bactériens analysés,% ont été correctement identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF; Dans la plupart des cas, l’absence d’identification% des isolats et l’identification erronée% des isolats étaient dues à des entrées incorrectes dans la base de données. Une identification précise de la spectrométrie de masse MALDI-TOF était significativement corrélée avec spectres de référence dans la base de données P = Le temps moyen requis pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF identification de l’isolat était de minutes pour un coût estimé de% -% des méthodes actuelles d’identificationConclusions La spectrométrie de masse MALDI-TOF est une méthode rentable et précise pour l’identification de routine d’isolats bactériens dans & lt; h en utilisant une base de données comprenant ⩾ spectres de référence par espèce bactérienne et un score d’identification Br système Brucker Il peut remplacer la coloration de Gram et l’identification biochimique dans un proche avenir

L’identification bactérienne est habituellement basée sur des tests phénotypiques, y compris la coloration de Gram, les caractéristiques de culture et de croissance, et le modèle biochimique Bien que certains de ces tests soient effectués en quelques minutes, une identification complète est possible. Des procédures conventionnelles et longues entravent le traitement approprié des patients en ce qui concerne les traitements antibiotiques et de soutien Une identification rapide et précise des espèces bactériennes couramment rencontrées est donc justifiée pour améliorer les soins des patients atteints de maladies infectieuses. Identification bactérienne basée sur les spectres peptidiques obtenus par laser matriciel désorption ionisation temps de vol MALDI-TOF spectrométrie de masse a été proposé & gt; Il a été récemment utilisé comme une méthode rapide, peu coûteuse et précise pour identifier les isolats qui appartiennent à certains phylums bactériens. Il a également été utile pour identifier les bactéries isolées dans des situations cliniques sélectionnées, comme la fibrose kystique , les études précédentes n’évaluaient pas l’efficacité de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour une utilisation systématique dans les cliniques, car elles incluaient des isolats bactériens recueillis dans des collections antérieures et cultivés dans des conditions sélectionnées pour l’étude ou des isolats incorporés sous-cultivés dans des conditions de croissance antérieures. à l’analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Figure AgrandirVersion grandissante des publications relatives à la désorption laser assistée par matrice applications de spectrométrie de masse à temps de vol en microbiologie médicale Les applications comprennent l’identification d’isolats, l’identification de profils spécifiques de résistance aux antibiotiques et le typage des isolats. de publications liées à la désorption laser assistée par matrice applications de spectrométrie de masse à temps de vol en microbiologie médicale Les applications comprennent l’identification d’isolats, l’identification de profils spécifiques de résistance aux antibiotiques et le typage d’isolatsNous avons évalué la performance et la rentabilité de MALDI Spectrométrie de masse -TOF pour l’identification systématique des bactéries, indépendamment de leur phylogénie et de leur relation avec une situation clinique spécifique

Matériaux et méthodes

Isolats bactériens Tous les isolats prélevés dans le sang, le liquide céphalo-rachidien, le pus, la biopsie, les voies respiratoires, les plaies et les selles ont été inclus prospectivement pendant une période de temps. Les isolats ont été récupérés après incubation aérobie, microaérophile et anaérobie des échantillons cliniques. sang, chocolat, Mueller-Hinton, soja trypticase, et milieu gélose MacConkey bioMérieux Après coloration semi-automatisée de Gram Aerospray Wiescor; Elitech et détermination des activités catalase et oxydase, les isolats ont été inoculés dans la bande d’identification Vitek appropriée à l’aide de l’appareil Vitek bioMérieux ou API ANA bande d’identification pour anaérobies bioMérieux Parallèlement, une seule colonie a été directement déposée sur une plaque cible MALDI-TOF Bruker Daltonik GmbH et de tels dépôts ont été faits pour chaque isolat. La préparation a été recouverte de pL de solution de matrice de solution saturée d’acide a-cyanohydroxycinnamique dans% d’acétonitrile, et de% d’acide trifluoracétique total d’isolats x taches ont été déposés par plaque, et l’échantillon matriciel a été cristallisé par séchage à l’air à température ambiante pendant des minutes. Spectrométrie de masse Les mesures ont été effectuées avec un spectromètre de masse Autoflex II Bruker Daltonik équipé d’un laser à azote -nm Spectra ont été enregistrés dans le mode linéaire positif, ns; tension de source d’ions, kV; tension de source d’ions, kV; tension de lentille, kV; gamme de masse, – kDa Chaque spectre a été obtenu après des prises en mode automatique à une puissance laser variable, et le temps d’acquisition variait de à s par spot Les données étaient automatiquement acquises à l’aide du logiciel de contrôle d’acquisition AutoXecute. Le logiciel BioTyper, version Bruker Daltonik GmbH, a été analysé par appariement standard avec paramétrage par défaut par rapport aux spectres d’espèces utilisés comme base de référence dans la base de données BioTyper. Ces spectres font partie intégrante de la version du logiciel BioTyper. les spots ont donné le score ⩾, l’analyse s’est arrêtée Quand les deux spots ont donné le score & lt ;, la spectrométrie de masse MALDI-TOF a lu les autres spots La méthode d’identification incluait le m / z de kDa Pour chaque spectre, pas plus que des pics compte et comparé avec les pics dans la base de données L’espèce bactérienne présentant le modèle peptidique le plus similaire avec le i le solate a été classé par son score d’identificationCritères pour l’identification des isolats L’identification précise des isolats à l’aide du système Vitek a été confirmée lorsque l’indice T était ⩾; l’identification à l’aide du système API a été confirmée lorsque le pourcentage d’identification était de ⩾% et l’indice T était ⩾ Comme pour l’analyse MALDI-TOF, nous avons utilisé des valeurs de score modifiées proposées par le fabricant: un score ⩾ l’identification du genre, et un score & lt; indiqué pas d’identification Un isolat a été considéré correctement identifié par spectrométrie de masse MALDI-TOF si ⩾ des spectres avaient un score ⩾ pour l’identification des espèces ou ⩾ pour l’identification du genre Pour les isolats discernés par analyse de phénotype de routine et spectrométrie de masse MALDI-TOF, Séquençage du gène de l’ARN ribosomique ou du gène rpo B, comme décrit ailleurs Un isolat a été correctement identifié lorsque sa séquence génique presque complète de S ARNr a donné une similitude de séquence de ⩾% avec la séquence d’espèces bactériennes la plus proche dans GenBank ; elle a été correctement identifiée lorsque sa séquence de gène rpo B partielle donnait une similitude de séquence de ⩾% avec la séquence d’espèces bactériennes la plus proche dans GenBank ou une base de données locale., MALDI-TOF retard et analyse des coûts Nous avons défini le retard d’identification de spectrométrie de masse MALDI-TOF comme retard. entre le dépôt de bactéries sur la plaque MALDI-TOF par le technicien et la fin de l’interprétation informatique des spectres c’est-à-dire l’identification prête à être transmise au clinicien Ce retard a été mesuré aléatoirement les jours non consécutifs Les coûts d’identification ont été mesurés des consommables spécifiques, le coût du traitement des personnels, et les provisions pour dépréciation annuelle des appareils respectifs Appareil de coloration de Gram, microscope, appareil d’identification et spectromètre de masse sur la base des isolats analysés par anAnalyse statistique Pour les espèces bactériennes à l’étude comprenant ⩾ isolats testés par spectrométrie de masse MALDI-TOF, nous avons testé la corrélation entre Précision de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF% d’isolats identifiés au niveau de l’espèce, c’est-à-dire avec un score d’identification de spectrométrie de masse MALDI-TOF et le nombre de spectres de référence pour cette espèce bactérienne dans la base de données BioTyper -Haenszel test

Résultats

Identification spectrométrique de masse MALDI-TOF concordante Des isolats prospectivement analysés sur une période d’une semaine, les isolats% n’ont pas donné une identification précise après lecture des taches parce que les deux taches étaient vides ou trop petites pour permettre une analyse quelconque. profil a ensuite été recueilli après avoir lu les autres taches d’isolats, y compris les genres et les espèces, avec – isolats par espèce,% a donné des identifications identiques par les méthodes actuelles d’identification et de spectrométrie de masse MALDI-TOF de ces isolats,% La spectrométrie de masse TOF et les tests de routine et% ont permis d’identifier le même genre par spectrométrie de masse MALDI-TOF et tests de routine Les isolats identifiés au niveau du genre comprenaient% d’espèces Actinomyces,% d’espèces Bacteroides,% d’espèces Citrobacter,% d’espèces Corynebacterium, % d’espèces d’Enterobacter,% d’espèces d’Enterococcus,% d’Escherichia coli,% des espèces de Fusobacterium,% d’espèces d’Haemophilus,% de Kingella kingae,% d’espèces de Klebsiella,% d’espèces de Lactobacillus,% d’isolats de Micrococcus luteus,% d’espèces de Propionibacterium,% d’isolats de Pseudomonas aeruginosa,% d’isolats de Staphylococcus aureus,% de coagulase -négatif des espèces de Staphylococcus, et% des espèces de Streptococcus

Table View largeDownload slideConcordance entre Vitek d’identification de routine conventionnelle; bioMérieux et ionisation par désorption laser assistée par matrice Temps de vol MALDI-TOF Identification par spectrométrie de masse Spectromètre de masse Brucker et base de données complétée par une base de données locale View largeDownload slideConcordance entre les routines d’identification classiques Vitek; bioMérieux et ionisation par désorption laser assistée par matrice Temps de vol MALDI-TOF Identification par spectrométrie de masse Brucker Spectromètre de masse et base de données complétée par une base de données localeEchec d’identification et identification erronée par spectrométrie de masse MALDI-TOF Quarante-six isolats% n’ont pas été identifiés par MALDI-TOF Ces isolats comprenaient% d’isolats de Propionibacterium acnes,% d’isolats de Peptostreptococcus micros,% d’isolats de Finegoldia maga,% d’isolats de Fusobacterium nucleatum,% d’isolats d’Anaerococcus vaginalis,% d’isolats de Prevotella intermedia,% d’isolats d’Atopobium rimae,% de Isolats de Bilophila wadsworthia et isolats pour chacune des espèces supplémentaires Tableau Des isolats supplémentaires% ont été identifiés par erreur par spectrométrie de masse MALDI-TOF même s’ils avaient des scores ⩾ Ces isolats incluaient% d’isolats de Streptococcus pneumoniae identifiés comme Streptococcus parasanguinis,% de Stenotrophomonas maltophilia isola Pseudomonas hibiscicola,% d’isolats de Shigella sonnei identifiés comme E. coli,% d’isolats d’Enterobacter aerogenes identifiés comme Citrobacter freundii,% d’isolats d’Enterobacter cloacae identifiés comme Klebsiella oxytoca,% d’isolats de Klebsiella pneumoniae identifiés comme E coli, isolat de Lactobacillus casei identifié comme isolat de Lactobacillus rhamnosus et de Streptococcus infantis identifié comme étant le tableau S parasanguinis Lorsque les spectres des isolats susmentionnés ont été ajoutés à la base de données de Bruker, une identification plus poussée était exacte

Diapositives et erreurs dans les tests phénotypiques de routine et l’ionisation par désorption laser assistée par matrice Temps de vol MALDI-TOF Spectrométrie de masse IdentificationTable Voir la grande diapositive de téléchargementDiscrepensions et erreurs dans les tests phénotypiques de routine et l’ionisation par désorption laser assistée par matrice Temps de vol MALDI Identification de la spectrométrie de masse par le phénotype Identification de phénotype erronée Les méthodes d’identification actuelles échouaient pour les isolats%, qui étaient tous anaérobies Tableau Un identificateur phénotypique était erroné pour les isolats% Un isolat phénotypiquement identifié comme Streptococcus mitis a été identifié comme espèce Actinomyces par spectrométrie de masse MALDI-TOF et a été confirmé Actinomyces naeslundii par séquençage du gène S rRNA Un isolat phénotypiquement identifié comme Aerococcus viridans a été identifié comme S parasanguinis par spectrométrie de masse MALDI-TOF et comme S infantis par séquençage partiel du gène rpo B Un isolat identifié phénotypiquement comme Gemella morbiloru Le streptocoque a été identifié comme espèce de Streptococcus par spectrométrie de masse MALDI-TOF et a été confirmé Streptococcus sanguinis par séquençage partiel du gène rpo B. Un isolat du groupe C Corynebacterium a été identifié comme espèce Lactobacillus par spectrométrie de masse MALDI-TOF et confirmé comme étant Lactobacillus zeae par S Séquençage du gène de l’ARNr Un isolat phénotypiquement identifié comme Staphylococcus epidermidis a été identifié comme espèce Propionibacterium par spectrométrie de masse MALDI-TOF et comme S epidermidis par séquençage rpo B Performances d’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF Pour les espèces bactériennes comprenant ⩾ isolats étudiés, le les isolats ont été identifiés au niveau de l’espèce par l’analyse de spectrométrie de masse MALDI-TOF était en corrélation étroite avec le fait que la base de données de référence pour cette espèce comprenait & gt; spectres de référence P = L’identification précise de la spectrométrie de masse MALDI-TOF était significativement corrélée avec le fait que la base de données de référence pour ces espèces incluait les spectres de référence P = retard comparatif et coût de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF isolats; les points par isolat étaient les minutes, y compris les minutes pour la préparation des plaques, les minutes pour le chargement des plaques et les minutes pour la lecture des plaques et l’interprétation des spectres, pour un retard moyen de minutes par isolat. Étant donné que notre protocole inclut une étape de séchage de matrice minime quel que soit le nombre d’isolats, le délai minimum pour l’identification de l’isolat MALDI-TOF de masse serait de minutes, y compris les minutes pour la colonie et la matrice dépôt et séchage, acquisition d’un spectre de temps et minute pour l’interprétation informatique et l’identification des spectres Le coût de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF tel que présenté dans ce laboratoire est présenté dans le tableau

Vue de la figure grandDownload slideDécoulement de travail et délai pour la désorption laser assistée par matrice ionisation time-of-flight MALDI-TOF spectrométrie de masse identification des bactéries dans cette étudeFigure View largeTélécharger diapositiveFlux de travail et délai pour la désorption laser assistée par matrice ionisation temps de vol MALDI- Identification par spectrométrie de masse TOF des bactéries dans cette étude

Table View largeDownload slideDelays, Costs, and Level of Training pour les méthodes d’identification des isolatsTable View largeTélécharger les diapositives, les coûts et le niveau de formation pour les méthodes d’identification des isolats

Discussion

De même, l’identification erronée de tous les organismes S sonnei comme E coli était due à une absence dans la base de données. C’était également le cas de près de la moitié des isolats de S pneumoniae. ont été identifiés comme S parasanguinis une espèce étroitement apparentée dans le groupe mitis des espèces Streptococcus , parce que la base de données incluait seulement des spectres de référence S pneumoniae et S parasanguinis L’incorporation de spectres S pneumoniae supplémentaires a résolu ce problème De même, S isolats S maltophilia ont été identifiés hibiscicola par spectrométrie de masse MALDI-TOF Nous avons supposé que cette discordance résultait d’un mauvais étiquetage des espèces bactériennes dans la base de données Bruker. En effet, P hibiscicola est un nom invalide pour un bâtonnet Gram négatif non fermentant qui a été démontré S maltophilia Addition de spectres corrects dans la base de données a résolu ces problèmes Environ% d’isolats ont été identifiés seulement à t le niveau du genre par analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF; Un exemple de cette identification a été fourni par P acnes, pour lequel seule la souche spectrale DSM était incluse dans la base de données Bruker. Nous avons émis l’hypothèse que ce spectre unique pourrait ne pas être représentatif de la vraie diversité des profils P acnes. La même remarque est vraie pour Bacillus cereus, pour laquelle la base de données Bruker n’incluait également que le spectre de référence. Nous avons également observé que la signification statistique de la corrélation entre la précision de l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF dans la base de données. et le nombre de spectres de référence a augmenté de ⩾ spectres de référence à ⩾ spectres de référence dans la base de données, indiquant qu’une base de données complète et représentative est, sans surprise, une exigence critique pour l’identification précise des isolats par spectrométrie de masse MALDI-TOF. , étude prospective incluse & gt; isolats, représentatifs de & gt; Nous avons utilisé un protocole expérimental très simple qui impliquait le dépôt direct de colonies bactériennes sur la plaque de spectrométrie de masse MALDI-TOF, quel que soit le milieu à base de gélose, sans aucune sous-culture ou colonie. préparation Le protocole direct utilisé dans cette étude a surtout supprimé les manipulations d’organismes et permis leur identification avec peu de retard. La procédure très basique que nous avons utilisée contraste avec certaines études dans lesquelles l’identification a été réalisée après repiquage sur milieu sélectif ou manipulation extensive de colonies [ ,,] après l’inactivation des organismes Les études qui ont également utilisé l’analyse directe des colonies bactériennes ont trouvé un délai pour l’identification de moins de minutes en raison du retard de & lt; -minute pour l’acquisition du spectre former des techniciens en ⩽ heure Dans notre laboratoire, les bactéries sont généralement déposées sur MALDI Plaques de spectrométrie de masse -TOF à: -: am, et toutes les identifications sont disponibles pour le clinicien à: am En outre, l’amélioration continue de la qualité des taches a permis de diminuer le nombre de taches de à isoler sans altérer les performances. Cette décision contribue grandement à la prise en charge clinique des patients, car la plupart des décisions médicales, y compris l’adaptation des régimes antibiotiques, l’ordonnancement de tests supplémentaires et la prévention des infections nosocomiales, sont effectuées avant midi. Nous avons calculé les coûts d’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF % -% du coût de l’identification phénotypique conventionnelle Nous n’avons pas observé de discordance entre la spectrométrie de masse MALDI-TOF et la coloration de Gram, suggérant que la spectrométrie de masse MALDI-TOF pourrait être utilisée comme première ligne sans coloration de Gram. coloration peut être utilisée uniquement pour les isolats présentant un score de spectrométrie de masse MALDI-TOF ⩽ et pour les isolats inhabituels es et isolats obtenus à partir de sites cliniques inhabituelsLes données recueillies prospectivement dans la présente étude ont démontré que l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF est une méthode efficace et rentable pour l’identification rapide et systématique des isolats bactériens dans le laboratoire de microbiologie clinique. la méthode d’identification de première intention, avant la coloration de Gram et tout profilage biochimique, en utilisant une base de données comprenant ⩾ spectres de référence par espèce bactérienne et un score d’identification ⩽ Le coût d’analyse diminuera lorsque les instruments de laboratoire seront utilisés plus souvent. pour une identification au niveau du sérotype ou de la souche, et un profil de résistance aux antibiotiques en quelques minutes, la spectrométrie de masse MALDI-TOF est une révolution en cours dans le laboratoire de microbiologie clinique. le coût des réactifs sera très faible

Remerciements

Nous remercions Carine Couderc pour son expertise technique dans les analyses de spectrométrie de masse MALDI-TOF Cette étude a été financée par le Laboratoire de Microbiologie, Assistance Publique-Hôpitaux de Marseille Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits