Irréversible 4-Aminopiperidine Transglutaminase 2 Inhibiteurs for Maladie de Huntington

Transglutaminase tissulaire 2 (TG2 suivez ce lien)

est une enzyme multifonctionnelle principalement connue pour son calcium dépendant

activité de réticulation via la formation de liaisons isopeptidiques.1 Des activités moins bien étudiées de TG2 comprennent l’amidase simple,

Activités GTPase, ATPase et protéine disulfure isomérase.2 − 4 TG2 a été caractérisé sous au moins trois formes, y compris ouvert, 5 fermé, 6 et ouvert-inactif

form.7 Délétion génétique de TG2 chez la souris

suggère un rôle pour l’activité TG2 dans la fonction énergétique mitochondriale.8 L’hyperactivité TG2 a été le plus étroitement associée

avec la maladie coeliaque et la maladie de Huntington (HD), et il y a de plus en plus

soutien pour les rôles dans l’inflammation et le cancer. 9 − 12HD est un dominant autosomique,

maladie neurodégénérative progressive caractérisée cliniquement

par des déficits moteurs, cognitifs et comportementaux. Expression TG2 et transglutaminase

il a été démontré que l’activité de ces cellules était augmentée dans le cerveau des patients atteints de MH 13, et des études in vitro et in vivo ont

TG2 en HD pathophysiology.14 − 17Plusieurs classes d’inhibiteurs de TG2 ont été

rapportés, dont la plupart sont irréversibles par nature18. En outre, nous avons signalé des effets covalents puissants et sélectifs

inhibiteurs portant une charge explosive d’acrylamide comme dans 1 (figure 11) .19 Le composé 1 a TG2 IC50 de 0,11 μ M, cependant, le métabolisme in vitro

les études de profilage ont identifié la stabilité du plasma comme une mise en garde

contre l’évaluation in vivo. Le composé 1 était l’un des

des exemples montrant une meilleure stabilité dans le plasma, ayant une demi-vie de

209 min dans le plasma de la souris. Preuve soutenant l’acrylamide amide

lien comme le site de l’instabilité métabolique a été obtenue par des tests

la stabilité plasmatique de l’analogue 2 de l’aniline (Figure 1) et la détection de sa formation en incubation plasmatique

du cyclopropylamide 1. L’aniline 2 a

aucune indication de métabolisme sur une période de 24 h dans le plasma de souris. le

ogive d’acrylamide a été présenté dans plusieurs EGFR irréversibles

inhibiteurs qui ont progressé aux essais cliniques, 20 suggérant que cette fraction n’est pas particulièrement sensible

au métabolisme et permettant aux composés d’atteindre des expositions plasmatiques acceptables

in vivo. Ainsi, nous présentons ici une structure – relation d’activité

(SAR) d’une nouvelle classe d’inhibiteurs de TG2 porteurs d’acrylamide

montrent une stabilité plasmatique améliorée.Figure 1Plasma stabilité de 1 et

métabolite putatif 2. Notre approche pour stabiliser les composés au plasma

exposition initialement axée sur le remplacement de l’anilide problématique avec

un alkylamide plus robuste. Les composés du tableau 1 ont été préparés principalement pour développer rapidement la SAR

à TG2 que cette série de composés possédait encore un anilide lié

Le groupe Cbz devrait être sensible au clivage du plasma. Sur identification

d’un remplacement approprié, une deuxième ronde de SAR serait nécessaire

pour remplacer le Cbz-anilide restant. Notre hypothèse de travail concernant

le mode de liaison de ces composés est resté compatible avec notre

modélisation antérieure et études SAR (figure ​ (figure 22) .19 Les interactions clés sont la capture de l’acrylamide

par Cys277 accompagné d’autres interactions de liaison hydrogène-acrylamide

avec les chaînes latérales de Trp241 et Gln276. De plus, il y a un

interaction hydrogène-liaison potentielle du sulfonyle avec le côté

chaîne d’Asn333, ce qui peut faciliter d’autres interactions avec les résidus

Leu312, Phe316, Ile331 et Leu420 qui tapissent un lipophile adjacent

pocket.Figure 2 (a) Pose d’ancrage de l’analogue 8a (tan) lié de manière covalente

à Cys-277 dans le site actif de TG2. (b) Recouvrement de 8a avec l’inhibiteur pentapeptidique A (magenta) contenant de la diazocétone décrit par Pinkas et al.5 Dans notre rapport antérieur, 19 nous avons établi que pour plusieurs isoformes de transglutaminase humaine,

une corrélation existe (r2 = 0,95) entre

les valeurs IC50 en utilisant une incubation de 30 min et

les constantes d’inhibition irréversible, kinact / Ki. Avec ceci en main, nous nous sommes appuyés sur

les valeurs IC50 pour guider l’effort de chimie médicinale.

En outre, toutes les données d’activité de ce rapport concernent la forme humaine

de ces enzymes sauf indication expresse. Comme le montre le tableau 1, nous avons commencé par préparer la 4-aminopipéridine (8a), qui semblait avoir la forme et la taille appropriées.

pour permettre à la fraction d’acrylamide d’atteindre Cys277, tandis que le sulfonamide

fourni un coude nécessaire pour diriger le groupe Cbz vers le lipophile

poche. Nous étions en outre intrigués par la proximité apparente

d’Asn333 au sulfonamide pourrait également contribuer à l’orientation

le groupe Cbz. L’activité TG2 de 8a était 2 – 3 fois

inférieur par rapport à l’anilide 1. Sans surprise, 8a avait une demi-vie inacceptable (4 h) dans le plasma de la souris.

Ajouter un méthylène comme en 8b, en réduisant la distance globale

entre le sulfonamide et la fraction acrylyle comme dans 8c, ou l’ouverture de la pipérazine comme dans 8d conduit à une multiplication de 20 fois

perte d’activité. Dans le prochain ensemble d’analogues, le point d’attache

de la fraction acrylamide sur la pipéridine a été changé de la position 4

à la position 3 en 8e et 8f, résultant

dans une perte complète de l’activité quand testé à 80 μ M. Réduire

la taille de l’anneau donne les 3-aminopyrrolidines 8g et 8h. Ceux-ci ont montré une activité légèrement améliorée, mais ces analogues

étaient 100 – 200 fois moins actif par rapport à 8a. Fait intéressant, l’activité s’est quelque peu améliorée

en taille de cycle à la 3-aminoazétidine (8i). Nous avons précédemment

noté une corrélation inverse de l’activité TG2 avec l’ampleur de

l’électronégativité de l’acrylamide. Alors que nous suspectons que l’électronégativité

(réactivité) est un facteur contribuant à la puissance TG2, il est probable

pas une caractéristique primordiale étant donné la gamme de 2 ordres de grandeur

la puissance observée dans le profil de sélectivité de la transglutaminase de 8a de l’arylacrylamide SAR.19 a donné les valeurs IC50 suivantes: TG2, 0,28 μ M;

TG1, 0,91 μ M; TG3, > 80 μ M; TG6, 8,9 μ M; et FXIIIa,

3.6 μ M.Table 1Acrylamide Anilide Linkage RemplacementsaL’importance de la géométrie et de l’interaction présumée

de la fraction sulfonyle avec Asn333 a été sondée en utilisant les composés 14 et 15 (figure 2) (figure 3).

Remplacement3).

Remplacement du sulfonyle par un carbonyle hybride sp2

abouti à 14, qui avait un TG2 IC50 de 8,9

μ M, une perte d’activité de 30 fois par rapport à 8a. Réduction supplémentaire du carbonyle en un hybride sp3

le méthylène conduit à 15, qui ont une CI50 de TG2 de 1,6 μ M, une perte de 6 fois par rapport à 8a. Celles-ci

les résultats indiquent que l’effet de l’hybridation sp3 à

ce centre domine tout avantage de la liaison hydrogène putative avec

Asn333 dans l’orientation du fragment benzylcarbamate vers le lipophile

Figure 3: Structures des sondes Asn333 14 et 15. En contrôlant le fragment 4-aminopipéridinyle de 8a, d’autres modifications ont porté sur le remplacement du

la liaison anilide restante. Comme le montre le tableau 2, ceci a été accompli en inversant le sens de la liaison amide.

dans les composés 9a – m et en assurant dans

la conception que seules les amines aliphatiques ont été incorporées pour améliorer

stabilité et interactions optimales avec les résidus Leu312, Phe316, Ile331,

et Leu420 qui tapissent cette partie du site de liaison. Notre initiale

composé dans cette étude, le phénéthylamide 9a, avait un TG2

IC50 de 0,18 μ M. Réduire la longueur de l’éthyle

linker comme dans 9b a entraîné peu de changement dans l’activité;

cependant, l’allongement de ce lieur par un méthylène comme en 9c a entraîné une perte d’activité de 4 fois. Réduire le nombre de rotatif

des liaisons en incorporant le linker éthyle dans un cyclopropane (9d) ou une tétrahydoisoquinoline (9e) a causé un double

perte de l’activité TG2, comme l’a fait la N-méthylation de l’amide (9f et 9g). Soulignant la nature lipophile de cette

partie du site, une amélioration faible mais significative de l’activité

par rapport à 9a a été atteint par 9h, qui

porte une fraction cyclohexyle à la place du phényle terminal; cependant,

activité significative a été perdue lors de l’incorporation d’un adamantyl plus gros

groupe (9i). Cette amélioration a également été perdue dans le 4-tétrahydropyranyle

et analogues morpholinyliques (9j et 9k), mais

il était néanmoins intéressant d’observer que le morpholinyle de base

les atomes d’azote et d’oxygène polaire ont été bien tolérés. Les trois derniers

composés dans cet ensemble (9l – n) aussi

tenté de réduire le nombre de liaisons rotatives par rapport à 9a. Ces changements étaient pour la plupart bien tolérés, bien qu’aucun

possédait une activité TG2 améliorée. Tableau 2 Inhibiteurs de l’amide TG2 réévaluésA Une nouvelle expansion du SAR autour du phénéthyle

L’amide est présenté dans le tableau 3. Comparé à 9a, l’addition d’un substituant 4-trifluorométhyle comme dans 9o a entraîné une perte d’activité de 3 fois. Cette activité était

principalement récupéré en 4-chloro 9p, et une petite amélioration

a été observée dans le 4-méthoxy 9q, qui avait une CI50 TG2 de 0,11   L’incorporation de grandes lipophiles

les groupes en position 4, comme en 9r et 9s, ont été défavorisés, tandis que le remplacement du phényle terminal

un groupement 2-naphtyle (9t) ou 7-quinolinyle (9u) aboutit à une activité pratiquement équipotente. Après 9q, plusieurs analogues alcoxy-substitués (9v – y) ont été étudiés; Cependant, aucun n’était aussi puissant que 9q. Parmi les composés restants, 3-chloro 9z et

3,4-diméthyl 9aa étaient équipotent avec 9a.Tableau 3Phenethylamide DerivativesaTransglutaminase profils de sélectivité contre la souris

TG2 (mTG2) et les isoformes humaines de TG1, TG6 et FXIIIa ont été obtenues

sur les composés les plus puissants. Les valeurs IC50 pour le composé 9q sont typiques: TG2, 0,11 μ M; mTG2, 0,055 μ M;

TG1, 1.2 et # x000b1; 0,047 μ M; TG6, 34 ± 0,062 μ M; et

FXIIIa, 6,4 ± 0,11 μ M. Il est important de noter que tous

des composés testés contre mTG2 ont une activité comparable à

valeurs TG2 humaines, confirmant la nature indépendante de l’espèce de cette

activité. La sélectivité typique contre TG1 était de 3 – 10 fois, et

&#x0003e: une sélectivité de 100 fois a été systématiquement observée contre le TG6,

10 – une sélectivité de 20 fois était typique contre FXIIIa. Le TG3

l’activité n’a pas été testée puisque les composés devaient être inactifs,

Le profil de sélectivité a révélé que des efforts supplémentaires pourraient être

nécessaire pour améliorer la sélectivité contre TG1 et FXIIIa; sélectivité

profils devraient être pris en compte dans toute décision de considérer ces

composés pour des études in vivo.Plusieurs composés ont été profilés

dans des dosages in vitro du métabolisme de la solubilité cinétique, de la stabilité du plasma,

stabilité microsomique du foie et perméabilité / efflux. Les résultats pour

le composé 9a était typique; il a montré une solubilité aqueuse

de < 0,01 mg / mL et clairance intrinsèque microsomale hépatique de la souris et de l'humain

valeurs de 99 et 595 μ L / min / mg, respectivement. Le taux élevé

du métabolisme était probablement due au phénéthyle et à l’aminopipéridinyle

fragments, qui sont sensibles au métabolisme oxydatif à plusieurs

des sites. Tous les composés testés étaient stables dans le plasma de la souris et de l’homme,

avec une demi-vie > 6 h et plusieurs montrant une demi-vie > 24 h.

De plus, 8a et 9z n’ont montré aucune preuve

de conjugaison au prototypique biologique nucléophile glutathion

(GSH) lors de tests in vitro sur une période de 120 h.21Pour être des agents efficaces pour les troubles neurodégénératifs,

il est avantageux que les composés possèdent un taux élevé de perméabilité

et un faible taux d’efflux. P-glycoprotéine (P-gp) est l’un des principaux efflux

transporteurs dans le cerveau; le potentiel pour les composés d’intérêt à

être effluxé par P-gp a été évalué dans une cellule transfectée MDCK-MDR1

ligne. Le composé 9a présentait un Papp A-B de 83 nm / s dans MDCK-WT et un taux effectif d’efflux (EER) de

44, indiquant une perméabilité modérée mais un efflux actif élevé via la P-gp.

Ces résultats étaient typiques de tous les composés testés. Combinant ceci

résultat avec les résultats des tests de stabilité microsomique indiqué

qu’aucun composé n’a été identifié comme étant un candidat approprié pour

évaluation in vivo dans le contexte de la HD. Le résultat de ce profilage

suggère que les composés peuvent être mieux adaptés en tant que traitements

Maladie coeliaque, où la perméabilité BBB serait un désavantage et

Une couverture systémique de 24 h peut ne pas être nécessaire pour l’efficacité.

résumé, nous avons développé une série d’inhibiteurs TG2 covalents ayant

sélectivité vis-à-vis des isoformes de transglutaminase étroitement apparentées

faible réactivité au GSH et excellente stabilité du plasma. Profilage ADME in vitro

indiqué des taux rapides de métabolisme oxydatif et un efflux de P-gp élevé,

suggérant qu’une optimisation supplémentaire des profils ADME sera nécessaire

atteindre une exposition cérébrale in vivo.