Découverte d’un puissant inhibiteur sélectif de la prostaglandine D synthase (HPGDS)

L’asthme est un trouble inflammatoire chronique des voies respiratoires qui provoque des épisodes récurrents de respiration sifflante, d’essoufflement, d’oppression thoracique et de toux chez les personnes sensibles. 1,2 La prostaglandine D2 (PGD2), un médiateur de l’allergie et de l’inflammation, est produite par les mastocytes et les cellules Th-2 dans divers tissus humains. La PGD2 est le médiateur de novo dérivé de la cyclooxygénase le plus abondant produit après dégranulation des mastocytes par les IgE3. On pense que le mastocyte, suite à la dégranulation provoquée par l’allergène, est la principale source de PGD2 dans les exsudats nasaux des patients allergiques. rhinite Les concentrations de PGD2 augmentent considérablement dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire après provocation allergénique, et l’observation que les patients asthmatiques présentent une bronchoconstriction lors de l’inhalation de PGD2 souligne les conséquences pathologiques de niveaux élevés de PGD2 dans les poumons.4 Le traitement par PGD2 produit une congestion nasale et une sécrétion l’homme et les chiens, et PGD2 est 10 fois plus puissant que l’histamine et 100 fois plus puissant que la bradykinine dans la production de blocage nasal chez les humains, démontrant un rôle pour PGD2 dans la rhinite allergique.5,6 PGD2 dérivé de mastocytes exerce son effet en activant deux des récepteurs couplés aux protéines G distincts (GPCR): le récepteur DP-1, un membre de la sous-famille des récepteurs prostanoïdes, et la molécule homologue aux récepteurs chimioattractifs récemment découverte exprimée sur les cellules T auxiliaires 2 (récepteur CRTH2). Le récepteur DP-1 est localisé sur le système vasculaire nasal et dans les cellules sécrétrices de mucine et est associé à un gonflement tissulaire et à une augmentation concomitante de la résistance nasale, alors que le récepteur CRTH2 est exprimé sur un sous-ensemble de lymphocytes T infiltrés dans la muqueuse nasale enflammée. est associé à l’induction de la migration chimiotactique et / ou l’activation de Th-2, éosinophiles et basophiles.7 − 9 Collectivement, ces données soutiennent un rôle pour PGD2 dans les maladies inflammatoires des voies aériennes supérieures et suggèrent que le blocage de l’action PGD2 au niveau de l’un ou des deux récepteurs pourrait être bénéfique pour le traitement des allergies nasales et d’autres états inflammatoires induits par la PGD2. Cela a suscité un intérêt significatif dans les deux DP-1 et CRTH2 comme cibles, et plusieurs publications sont apparues décrivant la conception de l’inhibiteur.10,11PGD2 est synthétisé à partir de l’acide arachidonique via l’oxydation par cyclooxygénase PGH2 (COX) et l’isomérisation de PGH2 en PGD2 par la prostaglandine D synthase (PGDS). La PGDS hématopoïétique (HPGDS) est responsable de la synthèse de PGD2 par les mastocytes et les cellules Th-2, tandis qu’une PGDS de type lipocaline (LPGDS) catalyse la production de PGD2 dans le système nerveux central, les organes génitaux masculins et le cœur12. On pense que le HPGDS joue un rôle central dans les processus allergiques et inflammatoires des voies aériennes et induit une vasodilatation, une bronchoconstriction, une infiltration éosinophile et lymphocytaire pulmonaire et une libération de cytokines chez les asthmatiques.12 L’inhibition des HPGDS peut être thérapeutiquement bénéfique dans le traitement des maladies allergiques. peut être plus efficace que le blocage de la DP-1 ou de la CRTH2 seule. 13HPGDS et LPGDS sont des synthases génétiquement distinctes qui sont probablement apparues comme une conséquence de l’évolution convergente. Ces isoenzymes sont nommées en fonction de leurs besoins différentiels en GSH en tant que cofacteur. La synthase PGD2 indépendante du GSH est un membre de la superfamille de la lipocaline, tandis que la synthase GSH-dépendante est le seul vertébré de la famille des glutathion S-transférases (GST) de la classe Sigma identifiée à ce jour.14,15 HPGDS est un homodimère cytosolique de 26 kDa sous-unités, et plusieurs structures cristallines ont été publiées.16,17 Ces structures révèlent un site actif bien défini, permettant une conception basée sur la structure des inhibiteurs. Il y a eu plusieurs rapports d’inhibiteurs puissants de l’enzyme18 − 20 de HPGDS avec HQL-79 en tant qu’inhibiteur efficace in vivo21 (Figure ​ (Figure1) .1). Dans cette lettre, nous décrirons notre effort pour identifier un inhibiteur actif par voie orale de HPGDS.22Figure 1Exemples d’inhibiteurs de la littérature.Un criblage de sous-ensemble a été réalisée sur la collection de composés Pfizer sur la base de la diversité structurelle. Cela a abouti à de nombreuses pistes pour d’autres manipulations. Notre groupe de production de prospects du Centre de recherche et de technologie a effectué un tri et une validation du plomb identifiant le thiazole 1 comme une avance avancée en vue d’une optimisation plus poussée (figure ​ (figure2) .2). Le thiazole 1 est un puissant inhibiteur de l’enzyme HPGDS (IC50, 10 nM) et de la cellule (IC50, 300 𢈒 1300 nM). En outre, le composé avait un profil pharmacocinétique (PK) très acceptable (Cl, 14 ml / min / kg, T1 / 2, 2 heures et BA, 20%). Dans l’analyse de ce composé, nous avons identifié plusieurs paramètres qui ont nécessité l’optimisation, le plus important, l’activité cellulaire pauvre du composé. En outre, nous souhaitions un échafaudage avec une nouveauté améliorée, jugée par une recherche de sous-structure dans Scifinder.Figure 2 Le plomb avancé comme un inhibiteur de HPGDS. Le thiazole pourrait facilement être divisé en trois domaines principaux pour l’exploration utilisant la chimie à haut débit: la tête, le corps et la queue. Notre effort initial était centré sur le corps, et une série d’hétérocycles ont été explorés qui pourraient retenir un réseau similaire de liaison hydrogène comme 1 avec une molécule d’eau conservée dans le site actif.23 Ces composés ont été facilement préparés à partir d’acides disponibles par couplage amide réaction avec 2; Les exemples sélectifs sont illustrés dans le tableau 1. La plupart de ces éléments constitutifs étaient disponibles dans le commerce, à quelques exceptions près, qui étaient disponibles dans notre réserve chimique interne. Table 1 Variation hétérocyclique du corpsCette itération initiale a fourni une mine d’informations sur la forme et la nature de l’hétéroatome égale à l’azote dans le thiazole. Seuls les hétérocycles ayant une localisation N similaire au thiazole tels que les composés puissants 5 et 6 se sont révélés actifs. L’emplacement de l’azote par rapport à la trajectoire de la queue s’est avéré être tout aussi important, comme illustré. L’activité de 4 (27 nM), dépourvue d’un atome d’azote central, était donc très surprenante et a confondu l’interprétation de la relation structure-activité jusqu’à ce que la calorimétrie isotherme montre que l’entropie était la principale force d’affinité24. échafaudages tels que 5 et 6 ont ensuite été évalués plus loin par plusieurs cycles de synthèse à haut débit axés sur la variation de la queue. Cela a été fait pour répondre à l’un de nos principaux objectifs, l’amélioration de l’activité cellulaire (Figure ​ (Figure3) .3). Il était clair que nous pouvions constamment préparer des inhibiteurs puissants de HPGDS, mais seulement une poignée de composés illustraient la puissance dans notre test cellulaire. Une observation clé a été faite que certaines sous-structures dans la queue avaient une probabilité plus élevée de bonne activité cellulaire. Les fragments les plus visibles étaient les benzylamines et les 4-aminopiperdines. Un effort concentré dans la préparation d’analogues de 5 et 6 contenant une queue avec la sous-structure 4-aminopipérine a donc été entrepris. Ces composés ont été conçus en utilisant une gamme de propriétés à la fois structurelles et physiques (MW, < 500; cLogp, < 4; et TPSA, < 120). L'incorporation de ces caractéristiques de conception aboutit à des composés significativement améliorés avec une activité significative dans le test des cellules (4% à 34%, comme jugé par IC50 &#x0223c, 100 nM) (figure ​ (figure 4) .4). Cela n'explique pas pourquoi les composés puissants illustrent une activité médiocre, et une gamme d'hypothèses telles que la perméabilité et l'efflux ont été explorées pour expliquer cela sans succès. Remarquable était la tolérance d'une large gamme de diversité structurelle dans l'échafaudage pipéridine, résultant en composés actifs cellulaires. Les structures de plusieurs de ces analogues actifs dans les cellules sont représentées dans le tableau 2. Figure 3 Corrélation de la puissance enzymatique avec l'activité cellulaire pour l'analogue 651 préparé couvrant une gamme de modèles.Figure 4 Effort focalisé sur les noyaux pyridine et pyrimidine contenant un noyau 4-aminopipéridine, un total de 631 composés.Tableaux 2 Exemples choisis de pyridines et d'analogues de pyrimidine avec une queue de 4-aminopiperdineLa queue simpliste trouvée dans le composé 8 l'a rendue idéale pour une brève étude du groupe de tête phényle. Une série d'analogues guidés par SBDD ont été préparés comme décrit dans le tableau 3. Malgré la sélection de petits changements, il a été trouvé que seul le substituant 3-fluor (8) était toléré tel que jugé par le dosage cellulaire. Le substituant fluoro (8) a fourni une amélioration significative en ce qui concerne la stabilité dans un essai de microsomes humains in vitro comparé à l'analogue non substitué 13. Le tableau 3Optimisation du groupe de tête aryle avec un corps de pyridine et un composé de pipéridine fixe 8 a été élu pour profilage basé sur son activité enzymatique et cellulaire. Le composé a montré une puissance égale contre HPGDS purifié provenant de l'homme, du rat, du chien et du mouton (IC50, 0,5 Ȣ 2,3 nM). Le composé 8 a été profilé dans un panel d'essais cellulaires pour cribler l'activité contre plusieurs cibles enzymatiques humaines pertinentes. Par exemple, ces dosages ont indiqué que 8 n'inhibe pas la L-PGDS humaine, la mPGES, la COX-1, la COX-2 ou la 5 LOX (valeurs de CI50 > 10000 nM). Ces données illustrent que 8 a une bonne sélectivité contre plusieurs cibles humaines pertinentes. La structure cristalline de 8 dans le complexe avec HPGDS a été déterminée et affinée à 2,1 Å résolution (Rfree = 22,2%, et RMSd liaisons = 0,007 Å) en trempant le composé dans des cristaux préformés (figure ​ (figure5) .5). La majorité des interactions faites entre l’inhibiteur et la protéine sont de type van der Waals, y compris des conditions favorables π − π interaction d’empilement faite entre le noyau pyridyle central du composé et le Trp104 de la protéine. De plus, deux liaisons hydrogène clés sont faites à l’inhibiteur, les deux ayant probablement un caractère ionique.La première liaison hydrogène est réalisée à travers une molécule de solvant jusqu’à l’extrémité carboxyle enterrée de la protéine. L’élimination de cette interaction par remplacement de la pyridine par un cycle phényle altère significativement la position de liaison et la puissance (> 100 fois la différence) du composé. La deuxième interaction polaire est faite entre l’azote amide de l’inhibiteur et l’anion thiolate du glutathion. Les liaisons hydrogène entre les atomes d’azote de l’amide et les anions thiolates restent fortes avec des distances interatomiques de 3,4 − 4,0 Å .25 Des distances similaires sont régulièrement observées entre le glutathion et d’autres inhibiteurs de HPGDS dans cette série.Figure 5Crystal structure of 8 bound at le site actif HPGDS. L’inhibiteur fait deux liaisons hydrogène clés (lignes pointillées) en plus des contacts substantiels de van der Waals dans la poche. Les propriétés physiques du composé ont été évaluées, et il a été trouvé que 8 avait une solubilité de 1,5 μ g / mL (3.9 μ M) à pH 6,50. Les propriétés de PK de 8 dans RataRats administré par voie orale avec 1 et 10 mpk 8 ont été sacrifiées à divers moments, et des concentrations plasmatiques de 8 et de la rate ont été dosées chez des rats à 1 mpk avec une biodisponibilité de 76% (Tableau 4). Les concentrations de PGD2 ont été mesurées. L’administration orale de 8 production de PGD2 bloquée dans la rate de rat; l’inhibition de la PGD2 était inversement corrélée avec la concentration plasmatique de 8 d’une manière dépendant du temps et de la dose (Figure ​ (Figure 6) .6). Les taux de PGD2 dans la rate diminuent lorsque 8 niveaux plasmatiques augmentent avec le temps; Les taux de PGD2 reviennent aux niveaux de base lorsque 8 niveaux plasmatiques diminuent. Figure 6: Test de modulation de la cible H-PGDS de Rat. Les rats traités avec 1 et 10 mpk 8 ont été sacrifiés à divers moments, et la concentration plasmatique de 8 et la concentration de PGD2 dans la rate ont été mesurées. La courbe de temps de concentration pour des doses de 1 et 10 mpk de 8 avec … L’effet de 8 dans un modèle de réponse des voies respiratoires induite par l’antigène chez les moutons allergiques a été explorée. Les réponses représentatives à la provocation allergénique et la réponse à la provocation au carbachol pour les deux essais sont montrées sur les Figures ​ Figures 77 et ​ et8.8. Les mêmes animaux ont été utilisés pour les essais sur les drogues et les véhicules. Chez les animaux traités avec le véhicule, la résistance moyenne des poumons (RL) a augmenté de 5 fois par rapport à la valeur initiale immédiatement après la provocation par voie aérienne avec l’antigène de somme d’Ascaris. RL est ensuite revenu lentement aux valeurs de référence à 4 h (EAR). RL a ensuite augmenté de nouveau 4 heures après le début de l’épreuve (LAR). L’hyperréactivité bronchique (AHR) a été déterminée 24 heures après le début du test en mesurant la variation de RL en réponse à l’administration de carbachol. Dans l’étude du véhicule, l’AHR était évidente, comme le montre la diminution de la PC400 après une provocation par l’antigène.27 Par contre, le traitement des moutons avec 8 a presque complètement empêché le LAR (inhibition maximale de 86% du LAR) et bloqué l’AHR (pas de changement dans l’antigène post-PC400), bien que 8 n’ait eu aucun effet sur l’EAR vérifier l’ensemble d’info. Figure 7: Evolution des changements induits par l’antigène dans la résistance pulmonaire des moutons traités avec un véhicule ou un véhicule contenant 8. Les valeurs sont des moyennes ± SDs; 2 moutons / groupe.Figure 8 Les moutons utilisés dans ces expériences développent AHR 24 h après l’épreuve d’Ascaris. Le véhicule n’inhibe pas l’AHR induite par l’allergène (chute significative du postantigène PC 400), alors que l’administration de 8 complètement protégé contre l’AHR induite par l’allergène au carbachol … En résumé, nous avons décrit la découverte d’une série d’inhibiteurs actifs de HPGDS . Le composé 8 est un inhibiteur sélectif pour HPGDS, et le composé a d’excellentes propriétés PK qui nous ont permis de l’évaluer dans plusieurs modèles animaux. Après l’administration orale, le composé inhibe la production de PGD2 d’une manière dépendante de la dose dans un modèle de rat in vivo. En outre, 8 illustre l’efficacité dans un modèle in vivo de l’asthme des moutons.