Utilisation De La Réaction De La Chaîne Polymérase Quantitative En Temps Réel Pour Surveiller L’évolution De La Charge De L’ADN De Brucella melitensis Pendant Le Traitement Et Le Suivi Post-Thérapeutique Chez Les Patients Atteints De Brucellose

Contexte Nous avons effectué une réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel Q-PCR pour suivre l’évolution de la charge d’ADN de Brucella melitensis du diagnostic initial au suivi post-thérapeutique chez des patients présentant des méthodes de brucellose Sur la base de la quantification fluorométrique en temps réel Roche Diagnostics Nous avons prélevé des échantillons de sang périphérique chez des patients atteints de brucellose L’analyse des charges d’ADN bactérien a été réalisée pour des groupes: patients n’ayant pas connu de rechute et patients ayant présenté une rechute dans la phase de suiviRésultats Q-PCR était% spécifique à B melitensis et a montré une sensibilité analytique de fg La sensibilité de la Q-PCR pour les infections initiales et les rechutes était de% Il n’y avait pas de différences statistiquement significatives entre les groupes en ce qui concerne la charge en ADN bactérien du diagnostic initial jusqu’à la fin du traitement. jusqu’à P & gt; L’évolution de la charge d’ADN bactérienne pendant la phase de traitement était similaire chez les patients ayant rechuté et n’ayant pas rechuté. Malgré une réponse positive au traitement et une forte diminution de la charge d’ADN bactérien après le début du traitement, les résultats de la Q-PCR A la fin du suivi, près de% des patients du groupe rechute et du groupe non récidivant, pour la plupart asymptomatiques, ont conservé de faibles charges d’ADN bactérien. Techniques de Q-PCR, nous avons systématiquement détecté l’ADN de B melitensis dans les échantillons de sang de patients atteints de brucellose tout au long du traitement et du suivi, malgré une guérison apparente de l’infection. Ces découvertes peuvent avoir des implications diagnostiques, pathogéniques et thérapeutiques

La brucellose humaine est une zoonose causée par des bactéries gram-négatives intracellulaires facultatives du genre Brucella La localisation intracellulaire de la bactérie la protège de certains des mécanismes de base du système immunitaire de l’hôte et de l’antibiothérapie Cela peut expliquer les maladies chroniques, les complications et les rechutes les plus fréquentes dans les mois suivant l’infection initiale, mais peuvent survenir aussi longtemps que des années après un traitement apparemment réussi La PCR en temps réel semble être un détecteur plus sensible et spécifique des espèces de Brucella que les méthodes conventionnelles de détection. y compris les tests hématologiques et de culture hémisphérique En outre, par rapport à la PCR conventionnelle, la PCR en temps réel facilite la quantification des acides nucléiques ainsi que l’automatisation et l’informatisation des données. Elle a également été reconnue comme un outil exceptionnel dans les tests de diagnostic moléculaire. Des tests de PCR ont détecté le genre Brucella et les espèces de Brucella en utilisant de l’ADN de Brucella de culture pure, et plusieurs rapports d’essais PCR en temps réel spécifiques au genre de spécimens humains ont récemment été publiés Bien que ces études aient effectué une détection qualitative des espèces de Brucella, aucune n’a quantifié la charge d’ADN bactérienne chez les patients atteints de brucellose. Le but de cette étude était de développer un test Q-PCR PCR quantitative en temps réel pour la mesure de la charge d’ADN de Brucella melitensis et d’évaluer l’évolution de la charge en ADN bactérien à partir du diagnostic jusqu’au suivi post-thérapeutique chez les patients atteints de brucellose Sur la base de la quantification fluorométrique en temps réel des produits PCR, nous avons réalisé une PCR en utilisant le système LightCycler ultra-rapide Roche Diagnostics L’utilisation d’une seule sonde d’hydrolyse exonucléase pour la détection des produits de PCR dans ce test garantissait une haute spécificité

Matériaux et méthodes

Espèces et souches de bactéries Les souches de Brucella utilisées dans cette étude ont été aimablement fournies par le Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria Aragón, Espagne. Les bactéries qui étaient phylogénétiquement et sérologiquement apparentées aux espèces de Brucella ont été fournies par la Communauté Espagnole de Cultivos Tipo Valencia, Espagne et Département de microbiologie de l’Université de Navarre Pampelune, Espagne Les différentes espèces utilisées sont répertoriées dans le tableau

La réapparition a été définie comme la réapparition d’une hémoculture positive pendant la période post-thérapeutique et / ou les signes et symptômes de l’infection à la brucellose. Le traitement pour les patients ayant présenté une rechute était le suivant:% recevaient une combinaison de doxycycline plus streptomycine,% de doxycycline plus gentamicine, et% de femmes enceintes était traitée avec de la rifampine.Analyse de l’évolution de la charge d’ADN bactérien du diagnostic initial au post-traitement -up a été réalisée séparément pour des groupes de patients: les sujets qui n’ont pas rechuté dans cette étude ci-après dénommés «patients non récidivants» et les sujets qui ont rechuté pendant le suivi ci-après dénommés «patients rechuteurs» Les comparaisons ont été faites de la bactérie Charge d’ADN dans les échantillons de sang entre les groupes pendant la phase de traitement initiale et la période de suivi Des échantillons sanguins ont été prélevés sur des donneurs sains. L’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de chaque centre, et tous les patients ont donné leur consentement éclairé. Culture bactérienne et méthodes sérologiques Deux échantillons sanguins ont été traités pour chaque spécimen avec un système Bactec Becton Dickinson selon Les techniques habituelles L’identification des espèces de Brucella a été faite selon les techniques microbiologiques standard Toutes les souches isolées ont été envoyées au Centre de Recherche et de Technologie Agroalimentaire Zaragoza, Espagne pour identification et biotypage définitifs Tous les isolats ont été identifiés comme biotype B melitensis Standard agglutination Des tests de Coombs ont été réalisés comme décrit ailleurs Extraction d’ADN à partir de souches bactériennes et d’échantillons cliniques Les cultures de chaque souche bactérienne ont été lavées à partir de plaques d’agar avec de l’eau stérile de grande pureté Milli-Q, Millipore SA subi des centrifugations à, g pour min Le supern atant a été transféré dans un tube frais et centrifugé à, g pour min. Des échantillons de sang périphérique des patients et des sujets témoins ont été recueillis dans EDTA Tous les échantillons ont été aliquotés et conservés à – ° C jusqu’à ce que l’ADN testé soit isolé avec un kit UltraClean DNA-BloodSpin Bio Laboratories, conformément aux instructions du fabricant Toutes les concentrations et puretés finales d’ADN ont été mesurées par spectrophotométrie. Primer et sonde TaqMan La séquence d’amorce avant EFQ était ‘-TGTTTCGGCTCAGAATAATCC A-‘, et la séquence d’amorce inverse ERQ était ‘-GCATGCGCTATGATCTGGTTA C-‘. La séquence de sonde TaqMan STqME était ‘- carboxy-fluorescéine FAM-AGCTTACCCGCCAATCTTCGCCCXT-‘ « X » est -carboxy-tétraméthyl-rhodamine [TAMRA], et les extrémités sont bloquées avec un groupe phosphate pour empêcher l’extension de la sonde dans la réaction PCR. les amorces produisent un amplicon de la paire de bases bp qui recouvre une région du génome de B melitensis, le numéro d’accession GenBank AE et l’élément d’insertion IS. Le même gène décrit ailleurs pour détecter l’ADN de B melitensis, mais nous avons utilisé différentes amorces et sondes La molécule rapporteur fluorescente à l’extrémité de la sonde TaqMan était FAM, et la molécule d’extinction était TAMRA La spécificité théorique des amorces et La sonde a été déterminée par comparaison avec la base de données GenBank à l’aide du Basic Local Alignment Search Tool BLAST Préparation du gabarit pour la courbe standard Le fragment B melitensis a été amplifié avec les amorces EFQ et ERQ et inséré dans pGEM-T Easy Vector Systems Promega. instructions du fabricant Après la préparation du plasmide, la concentration d’ADN a été déterminée avec un spectrophotomètre à nm et le nombre de copies correspondant calculé. La courbe standard a été construite en traçant les valeurs logarithmiques d’un nombre connu de copies bactériennes par rapport au seuil du cycle. Dosages PCR Pour chaque capillaire en verre LightCycler, nous avons ajouté μL de mélange PCR contenant nM d’amorces, nM de sonde TaqMan, ng d’ADN humain, mM de concentration finale en MgCl et μL de solution de concentration x des sondes d’hybridation d’ADN LightCycler-FastStart maître Roche Diagnostics Les conditions de cyclage consistent en une dénaturation initiale à ° C pendant min suivie de cycles à ° C pour s, à ° C pour s, et à ° C pour s La fluorescence a été acquise une fois par cycle après l’étape d’extension en utilisant des filtres F / F, et le nombre de copies de B melitensis par millilitre de sang a été calculé à partir de la courbe standard. des contrôles positifs ont également été inclus dans chaque analyse Q-PCR Les échantillons collectés ont été analysés au hasard en triple exemplaire en une seule fois. Le résultat de la Q-PCR a été considéré comme positif quand au moins des réplicats étaient positifs.Analyse statistique Le test χ ou le test exact de Fishers étaient utilisé pour comparer les variables catégorielles entre les différents groupes, et le test t de Student ou le test de la somme des rangs de Wilcoxon ont été utilisés pour comparer les variables continues AP valeur de & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

Spécificité et sensibilité du test Q-PCR La sensibilité analytique a été réalisée avec un dosage linéaire sur des ordres de grandeur allant de ng à fg. B Le test spécifique au melitensis pourrait détecter aussi peu que fg d’ADN Ceci est équivalent à la copie du génome original à partir duquel l’ADN a été extrait en supposant que – fg d’ADN est équivalent au génome. L’amplification des dilutions en série d’un plasmide avec le fragment cloné de bp de la souche Rev de B melitensis a révélé une gamme linéaire de détection – copies par mélange réactionnel, Par conséquent, à partir de cette courbe standard, nous avons déterminé le nombre de copies de bactéries présentes dans ng d’ADN génomique humain. par interpolation de la valeur Ct de chaque test Q-PCR à la courbe standardLe test Q-PCR était% spécifique Cinq espèces différentes du genre Brucella, souches phylogénétiquement apparentées à Br Les bactéries gram-négatives présentant des réactions sérologiques croisées avec les espèces Brucella sont toutes des résultats négatifs avec le tableau Q-PCR, à l’exception des souches M et Rev de B melitensis biovar, de la souche de type biovar et de la souche de type biovar Ether. Tous ont eu des résultats positifs de Q-PCR Les patients cliniques avec un diagnostic initial de brucellose sont montrés dans le tableau La durée des symptômes avant le diagnostic était – jours médiane, jours La sensibilité de Q-PCR, le test de Coombs, l’hémoculture, et la norme l’agglutination en tube au moment du diagnostic initial était respectivement de%,%,% et%

Caractéristiques cliniques à l’entrée des patients atteints de brucellose Bien que tous les patients aient démontré une résolution des symptômes à la moitié de la période de traitement, des échantillons de sang positifs pour la culture ont été obtenus durant cette phase chez des patients sans récidive et chez des patients sans récidive. Patients rechuteurs Cependant, à la fin du traitement, les cultures de tous les échantillons de sang étaient négatives Après le traitement initial et la récupération, les patientes et les mâles ont finalement présenté des rechutes symptomatiques entre les jours et les jours médians, plusieurs jours après la fin du traitement. résultats de culture de sang, et rechute clinique expérimentée seulement La sensibilité de Q-PCR pour les patients de rechute était% contre% pour l’hémoculture,% pour le test de Coombs, et% pour l’agglutination tubulaire standard P =, respectivementQuantification de B melitensisDNA charge dans la clinique Tous les échantillons de sang provenant de donneurs sains qui étaient nos sujets témoins étaient négatifs pour B melitensis. Par conséquent, la spécificité de notre test Q-PCR était de% Analyse de l’évolution de la charge d’ADN bactérien du diagnostic initial au suivi post-thérapeutique a été séparé en groupes: les patients du groupe non récidivant et les patients du groupe rechute Une comparaison de la quantité de bactéries ADN entre les groupes depuis le diagnostic initial jusqu’à la fin du suivi n’a révélé aucune différence statistiquement significative P & gt; L’évolution de la charge d’ADN bactérien chez les patients non récidivants est montrée à la figure. Au diagnostic initial, la charge moyenne d’ADN de B melitensis ± SD était de ± copies / ml, – copies / mL Pendant la période de traitement, nous avons observé une diminution spectaculaire dans la charge d’ADN bactérienne ± copies / ml; intervalle, – copies / mL pour les premières semaines, coïncidant avec la disparition des symptômes Cette diminution a été suivie d’une légère augmentation de la quatrième à la septième semaine, avec une charge moyenne d’ADN bactérien de ± copies / mL, – copies / mL l’achèvement du traitement, les résultats de Q-PCR pour les patients% sont restés positifs, avec une charge moyenne d’ADN bactérien de ± copies / ml gamme, – copies / mL Peu de temps après la fin du traitement, nous avons observé une autre légère augmentation de la charge d’ADN bactérien ± copies / mL; intervalle, – copies / mL jusqu’au quatrième mois après le traitement, après quoi il a progressivement diminué pendant le reste de la période de suivi à ± copies / ml gamme, – copies / mL Les résultats Q-PCR des patients non récidivistes sont restés positifs au conclusion de l’étude L’évolution de la charge d’ADN bactérien chez les patients en rechute est montrée sur la figure

Figure AgrandirVersion de Brucella melitensis Charge d’ADN pendant la phase de traitement et suivi post-thérapeutique chez les patients non récidivants Bar, déviation standardFigure View largeTélécharger diapositiveEvolution de Brucella melitensis Charge de l’ADN pendant la phase de traitement et suivi post-thérapeutique chez les patients non récidivants , déviation standard

Figure View largeTélécharger la lameEvolution de Brucella melitensis Charge de l’ADN pendant la phase de traitement et suivi post-thérapeutique chez les patients rechuteurs Barre, écart-type; astérisque, point de rechuteFigure View largeTélécharger diapositiveEvolution de Brucella melitensis Charge de l’ADN pendant la phase de traitement et suivi post-thérapeutique chez les patients ayant rechuté Barre, écart-type; astérisque, point où la rechute a été experiencedDuring la phase initiale du traitement, les patients rechute ont présenté une courbe de charge de l’ADN bactérien similaire à celle des patients nonrelapse au moment du diagnostic initial, la charge de l’ADN bactérien moyenne ± écart-type pour les patients du groupe de rechute était de ± copies / mL intervalle, – copies / mL La charge d’ADN bactérien a diminué jusqu’à ± copies / mL, – copies / mL peu après l’instauration de l’antibiothérapie et a légèrement augmenté après la quatrième semaine de traitement à ± copies / mL, – copies / mL À la fin du traitement, la charge moyenne d’ADN bactérien a chuté à ± copies / mL, – copies / mL, et les résultats de la Q-PCR des patients sont demeurés positifsDurant la phase de suivi de l’étude, les patients ont présenté des rechutes à divers moments Les pics de post-traitement observés dans la figure correspondent à des épisodes de rechute microbiologique. Au diagnostic, la charge moyenne en ADN bactérien ± SD des patients du groupe rechute était de ± copies / ml, – copies / m L Dans le groupe rechute, la charge moyenne d’ADN bactérien ± écart-type était de ± copies / ml, – copies / ml pour les personnes ayant une rechute microbiologique et ± copies / ml, – copies / ml pour les rechutes cliniques P = À la conclusion de la phase de suivi, les résultats Q-PCR des patients rechuteurs sont restés positifs Nous avons seulement pu surveiller les patients pour & gt; mois après le traitement, dont les résultats de Q-PCR ont continué à être positifs, bien que les charges d’ADN bactérien soient faibles, – copies / mL Deux des patients avec des résultats Q-PCR positifs à long terme étaient des patients rechuteurs avec diverses complications focales. Le troisième patient, un patient non récidivant, est resté asymptomatique pendant toute la durée du suivi post-thérapeutique de mois. L’étude actuelle ne visait pas à analyser l’influence de la monothérapie versus l’association médicamenteuse sur les résultats du traitement, mesurée par le taux de rechute. charge de l’ADN melitensis Néanmoins, nous avons observé que% des patients ayant reçu une monothérapie avaient des résultats positifs à la Q-PCR à la cessation du traitement, dont% de patients expérimentés. après traitement, aucun d’entre eux n’a connu de rechute, ce qui implique que le traitement d’association est plus efficace. Cependant, du% des patients ayant reçu charge d’ADN bactérienne des copies / mL après la fin du traitement, et% de rechute expérimentée Un autre patient du groupe recevant un traitement d’association a connu une rechute; Nous n’avons pas pu obtenir d’échantillon de sang de ce patient après l’achèvement du traitement. En résumé, des patients ayant présenté une rechute provenaient du groupe de traitement combiné. En termes de comparaison des charges d’ADN bactérien entre monothérapie différences statistiquement significatives ont été trouvées P & gt;

Comparaison de la charge d’ADN bactérien et des résultats du traitement des patients recevant une monothérapie et des patients recevant un traitement combiné pour les premiers épisodes de brucelloseTable View largeTéléchargement Comparaison de la charge d’ADN bactérien et du traitement des patients recevant une monothérapie et des patients recevant un traitement combiné pour les premiers épisodes de brucellose

Discussion

En ce qui concerne la Q-PCR en tant qu’outil de diagnostic de la brucellose, nos résultats démontrent un% de sensibilité et de spécificité pour les infections initiales et les poussées. Cependant, le groupe témoin ne comprend que des donneurs de sang sains. exposition épidémiologique aux bactéries Par conséquent, de nouvelles études incluant des patients avec d’autres maladies infectieuses, des patients avec des épisodes antérieurs de brucellose et des personnes en bonne santé exposées aux espèces de Brucella sont nécessaires pour évaluer la spécificité du test. obtenir une image à long terme de l’évolution de l’ADN bactérien dans le sang, reflétant possiblement la dynamique sous-jacente de la maladie. La caractéristique la plus significative des infections des patients rechuteurs et non récidivistes dans cette étude est la persistance de la charge d’ADN de B melitensis. le sang à la fin du traitement, malgré la rec À la fin du suivi, près de% des patients rechutaient et les patients non récidivants, dont la plupart étaient asymptomatiques, continuaient à avoir de faibles charges d’ADN bactérien. En ce qui concerne les courbes de charge de l’ADN bactérien, nous avons observé une augmentation et une diminution du nombre de copies d’ADN par millilitre de sang à mi-traitement chez les patients ayant rechuté ou non. Ce modèle suggère une interaction complexe entre la suppression des antibiotiques, les mécanismes de survie des bactéries et la réponse immunitaire de l’hôte à la maladie. Pendant le traitement, il n’y avait pas de différences significatives entre les patients rechuteurs et non récidivants par rapport à l’évolution bactérienne. Charge d’ADN Ainsi, le suivi des charges d’ADN bactérien chez les patients subissant une antibiothérapie ellose peut ne pas faciliter la prédiction de rechuteAutres études utilisant la PCR conventionnelle ont documenté l’ADN des espèces Brucella chez les patients symptomatiques et asymptomatiques post-traitement de la brucellose [,,] Morata et al ont décrit un individu asymptomatique présentant des résidus d’ADN bactérien après la thérapie. De même, une étude de Queipo-Ortuño et al décrivait des sujets asymptomatiques avec des résultats PCR positifs. Dans notre étude, nous avons systématiquement obtenu un nombre plus élevé d’échantillons positifs par Q-PCR que les études mentionnées ci-dessus, peut-être car la sensibilité de la Q-PCR est supérieure à celle de la PCR conventionnelle. Une charge bactérienne persistante détectée par PCR a également été rapportée dans des infections humaines causées par Borrelia burgdorferi et Mycobacterium tuberculosis Bien que les résultats positifs de Q-PCR ne prouvent pas l’infection active par des bactéries vivantes, la persistance de l’ADN soulève la possibilité d’une infection latente à l’intérieur de la Il a été démontré que les espèces de Brucella peuvent survivre dans les cellules macrophages, éludant la réponse immunitaire de l’hôte et empêchant l’action efficace des antibiotiques Fait intéressant, les patients de notre étude qui avaient des résultats négatifs à la Q-PCR ont rechuté. Bien que l’ADN de B melitensis ne soit pas présent dans le sang, Spink et Bradley décrivent une souris modèle expérimentale infectée par B melitensis, à partir de laquelle des unités formant des colonies de Brucella ont été retrouvées longtemps après la conclusion. Les implications thérapeutiques de l’analyse Q-PCR, le contexte clinique du patient et les limites de la technique doivent être pris en compte lors de l’interprétation des résultats De nombreux patients asymptomatiques dans notre étude ont eu des résultats positifs à la cessation du traitement et au cours du suivi. -up sans rechute Par conséquent, un résultat Q-PCR positif d’un patient asymptomatique rec Cependant, un résultat positif à la Q-PCR d’un patient symptomatique non traité indique probablement la nécessité d’un traitement antibiotique Inversement, en raison de la sensibilité de la technique, un résultat Q-PCR négatif En conclusion, nos données suggèrent que la brucellose peut être une maladie chronique récurrente comparable à celles causées par des agents pathogènes intracellulaires tels que le M. tuberculosis, dans lequel les bactéries persistent pendant et après le traitement, Malgré un traitement antibiotique approprié et une bonne réponse de l’hôte Pour mieux comprendre l’évolution de la brucellose, l’importance de la persistance de l’ADN de B melitensis chez les patients atteints de brucellose et la nature des rechutes, les études prospectives impliquant des personnes plus grandes traitées de manière homogène devraient le cours post-thérapeutique à long terme de la maladie e

Enquêteurs participants

J Solera, E Martínez-Alfaro, JJ Blanch, F Mateos, S Lorente, E Navarro, MJ Castaño, V Rodríguez, R Morote, CD Cuenca, MD Muñoz, LI Garijo, AM Faire un don, et Hôpital Général E Pescador, Albacete, Espagne; J L Beato, F J Polo, J C Segura, et Hôpital C Romero Hellín, Albacete, Espagne

Remerciements

Nous remercions Lourdes Gómez de l’Instituto de Desarrollo Regional Albacete, Espagne pour les conseils techniques, la technicienne Vanessa Rodriguez pour sa contribution à l’étude, et Alexandra Salewski Müller pour l’aide dans la rédaction et la traduction du manuscrit Soutien financier Ministère espagnol de la Santé Fondo de Investigación Sanitaria et la Junta de Castilla-La Mancha d’Espagne subvention de la Consejería de Sanidad /, la Consejería de Sanidad subvention GC / à MJC, et la bourse Investigadores Expertos IE- aux conflits d’intérêts ENPotential Tous les auteurs: aucun conflit