n Fluorescent Human EP3 Receptor Antagonists

Le récepteur EP3

est un membre de la famille des récepteurs couplés à la protéine G des prostanoïdes (GPCR).

Les prostanoïdes sont des produits de la cascade de l’acide arachidonique. Arachidonique

l’acide est libéré de la membrane cellulaire et converti sur la prostaglandine

G2 (PGG2) et Prostaglandine H2 (PGH2) dans les cinq prostanoïdes: Prostaglandine E2 (PGE2), PGF2 &#x003b1, PGI2, PGD2 et thromboxane A2. PGE2 interagit à travers

quatre GPCR: EP1, EP2, EP3 et EP4. Le récepteur EP3 est spécial en raison de ses neuf humains

variantes d’épissage.1 L’activation du récepteur EP3 joue un rôle crucial dans la génération de fièvre, 2 hyperalgésie, hyperactivité vésicale, 3 contraction utérine, sécrétion d’acide gastrique,

contraction musculaire lisse du tractus gastro-intestinal, libération de neurotransmetteurs,

réabsorption de sodium / eau dans le rein, l’agrégation plaquettaire, et la thrombose.4 − 6 Les récepteurs EP3 sont exprimés sur les plaquettes et intracellulaire inférieure

Niveaux d’AMPc par couplage Gi, entraînant une sensibilité accrue

Il existe de nombreux efforts pour concevoir des antagonistes de l’EP3 en tant que nouveaux agents antiplaquettaires qui ne prolongent pas les saignements.

puisque ni les plaquettes ni les parois artérielles saines ne produisent de PGE2.8Localisation et distribution

du récepteur sont importants pour

comprendre ses fonctions, effets et interactions. Donc,

il y a un besoin de marquer les ligands affines avec des outils de visualisation.

Une méthode de choix est le radiomarquage. La [3H] PGE2 en tant qu’agoniste complet n’est pas sélective aux quatre sous-types de récepteurs EP.

Pour éviter l’équipement coûteux et l’exposition nocive à la radioactivité,

le marquage par fluorescence devient de plus en plus important. Pour le meilleur

à notre connaissance, aucun ligand EP3 marqué par fluorescence a

été synthétisé jusqu’à présent. Notre objectif était de concevoir un sous-type sélectif de haute affinité

Les ligands EP3 avec des propriétés de fluorescence appropriées. Celles-ci

les substances devraient être applicables comme outils pharmacologiques pour étudier

les sous-types de récepteurs EP3 correspondants in vitro sur cellule

ainsi que sur les conditions tissulaires. Une recherche bibliographique a été trouvée

dans certains haute-affinité et sous-type sélectif

Antagonistes EP3 entre autres.9,10 Référence

Les structures en plomb ont été synthétisées comme indiqué précédemment.11 Dans la conception structurelle, nous avons envisagé de

du résidu lipophile de l’acide cinnamique ortho-substitué

dérivés et en le remplaçant par un fluorophore, étiqueté via un court

diméthylèneoxy spacer (Figure ​ (Figure1) .1). Pratique

les fluorophores doivent conserver le caractère lipophile. Maintenir

l’affinité, nous avons utilisé de petits groupes fluorescents couplés via le court

spacer pour éviter l’encombrement stérique. Fluorophores de petites molécules établies

sont, par exemple, cyanoisoindole, 12 Sanger

réactif, 13 groupes de pyryllium, 14,15 et fluorescéine16,17. Ces groupes fluorescents

pourrait être couplé au groupe amino réactif du diméthylèneoxy

spacer of 3.Figure 1Conception de ligands hEP3R fluorescents.La synthèse a commencé avec la réaction de Mitsunobu18 de N-Boc-éthanolamine avec

l’eugénol. La résultante

le produit a été converti avec trans-2-bromocinnamique

acide par réaction de Heck.11 Le produit brut

a été purifié par chromatographie sur colonne et cristallisation

régioisomères résultant distincts. Le groupe Boc protecteur a été clivé

dans des conditions acides. Le groupe amino libre a été couplé avec des

fluorophore et l’addition de triéthylamine ou de diisopropyléthylamine.19 Le groupe carboxylique libre a été transformé en

un groupe acyl sulfonamide par des réactions de couplage avec le 1-éthyl-3- [3-diméthylaminopropyl] carbodiimide

chlorhydrate (EDC) / 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) .20 Tous les ligands EP3R fluorescents ont été purifiés par

Chromatographie sur colonne (Schéma 1). Fluorescence

la caractérisation a été déterminée à une concentration de 10 μ M

dans un tampon (Tris 50 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, et EDTA 1 mM)

(Tableau 1) .Synthèse 1 des ligands hEP3R marqués par fluorescence Tableau 1Affinités de 1 – 10 à hEP3R et des structures de référence de caractérisation de fluorescence et tous les nouveaux fluorescents synthétisés

Humain

Les ligands du récepteur EP3 (hEP3R) ont été testés

leur affinité à l’hEP3R dans une compétition radioligand

test de liaison mesurant [3H] PGE2 se liant à

les récepteurs prostanoïdes EP3 humains recombinants (ChemiSCREEN

préparation de la membrane) (Merck Millipore, Schwalbach, Allemagne) (tableau 1). Nous avons trouvé des valeurs de Ki 5 fois supérieures à 10 fois plus élevées que celles rapportées par Belley et al.9,10. Ce groupe de travail a utilisé un test de test différent, en profitant

d’un variant d’épissage spécifique de hEP3R (EP3 & III; 2013), et utilisé le mélange régioisomérique résultant de la

Heck reaction.9 La structure de référence

avec le groupe amino réactif (3) a montré une perte d’affinité hEP3R provoquée par le groupe amino polaire et basique. Fluorescent

les composés ayant la plus forte affinité à hEP3R représentent 4 – 6. Leurs affinités hEP3R

sont dans la même gamme de concentration que le composé de référence 2. Les trois ligands fluorescents hEP3R émettent un bleu

longueur d’onde de fluorescence (300 – 450 nm) où interférences avec

l’autofluorescence des tissus est attendue. Ces composés possèdent de petites

Stokes déplace potentiellement provoquant l’auto-trempe, et la fluorescence

les intensités d’émission étaient faibles par rapport à 9 et 10 (information à l’appui). Pyryllium

ligands couplés à un colorant (7 et 8)

affinités modérées à l’hEP3R. L’introduction d’un autre

double liaison a augmenté le caractère lipophile du fluorophore

et a entraîné une augmentation de l’affinité à hEP3R ainsi

comme un décalage rouge de la longueur d’onde d’émission de fluorescence malgré une diminution

de l’intensité de fluorescence (7 → 8).

Caractéristiques de fluorescence de 8 avec grand décalage de Stokes

et les longueurs d’onde d’émission de fluorescence rouge sont plus favorables à l’utilisation

que les autres ligands hEP3R fluorescents. Le grand Stokes

le déplacement du ligand hEP3R marqué au pyryllium évite l’auto-extinction

pendant l’excitation laser avec le microscope à balayage laser confocal,

et l’émission de fluorescence rouge réduit l’interaction avec la plupart du temps

autofluorescence bleue. Composés marqués au fluorescéinisothiocyanate (FITC)

(9 et 10) possèdent des quarts de travail modérés de Stokes

et sont émis brillamment dans le spectre de fluorescence verte. Cependant, 9 et 10 affinités perdues à hEP3R, la plupart

probablement causée par la structure polaire phénolique et acide de la

Fluorophore FITC. Structures de référence (1 et 2) et ligands

avec des affinités élevées à hEP3R (4 et 5) ou avec les propriétés fluorescentes les plus prometteuses (8) ont été criblés sur leurs sélectivités à tous les récepteurs EP

sous-types dans des tests de liaison à la compétition de radioligand utilisant [3H] PGE2 à des prostanoïdes humains recombinants EP1 –

récepteurs (préparation de membranes ChemiSCREEN) (Merck Millipore) (Tableau 2) .21 Tous les composés testés

sont sélectifs de hEP3R. Simplement, composé 8 spectacles

une certaine affinité croisée à hEP4R.Tableau 2Affinities de 1, 2, 4, 5 et 8 à hEP1R, hEP2R, hEP3R, et hEP4RTo tester l’utilité comme outils pharmacologiques, tous

fluorescent

Les ligands EP3 ont été incubés sur l’adénocarcinome du colon humain

cellules de grade II (cellules HT-29) dans des plaques à six puits. Expression du

hEP3R a été induite par le retrait du sérum fœtal bovin (FBS)

pour 72 h.22 cellules marquées avec fluorescent bleu

Les ligands hEP3R (4 – 6) étaient

colorées en plus avec de l’iodure de propidium, 23 et des noyaux de cellules incubées avec du fluorescent rouge marqué au pyryllium 8 ont été colorés avec du bleu fluorescent 4, 6-diamino-2-phénylindole.

(DAPI) .24 Tous les composés se sont avérés être

stable dans les conditions d’essai et être approprié pour la détection

des hEP3Rs sur des cellules HT-29 affamées par des cellules confocales fluorescentes

microscopie à balayage laser. Les hEP3R peuvent être détectés dans le

cytoplasme des cellules HT-29. Les composés fluorescents bleus (4 – 6) doivent être incubés à des concentrations élevées

(3 μ M) pour éviter les interférences avec l’autofluorescence. En comparaison

avec les cellules HT-29 témoins, la liaison spécifique des ligands fluorescents hEP3R pourrait être augmentée jusqu’à 60% par le retrait des milieux

(4, 58%, 5, 55% et 6, 60%)

(Figure ​ (Figure2) .2). Par conséquent, hEP3R

l’expression a été augmentée jusqu’à 60%. Liaison spécifique de fluorescent

Les ligands hEP3R pourraient être déplacés par un excès de 3 fois 1 (Figure ​ (Figure3) .3). Le ligand hEP3R fluorescent rouge 8 a pu être détecté sur des cellules HT-29 après

retrait des milieux à une concentration de 300 nM (2 fois la valeur Ki). Cellules de contrôle HT-29 non-constantes et cellules HT-29

après l’induction de hEP3R étaient faciles à distinguer de

L’un et l’autre. Cytoplasme et la membrane externe du noyau de HT-29

les cellules de contrôle ont montré une fluorescence avec des intensités plus faibles les affamés

Cellules HT-29 après marquage avec un ligand de pyryllium fluorescent rouge 8. Le marquage par fluorescence de hEP3R avec 8 pourrait être spécifiquement déplacé par un excès de 3 fois de 1 (Figure 4) .4). Allongement de l’incubation

temps jusqu’à 24 h a entraîné l’accumulation de hEP3R marqués par fluorescence dans les domaines internes du cytoplasme. Internalisation des récepteurs

n’a pas pu être observé (Figures ​ (Figures33 et ​ and4) .4). En conséquence, le marqueur fluorescent rouge pyryllium

le ligand 8 pourrait être utilisé à de faibles concentrations. Fluorescent

les signaux étaient faciles à détecter, et aucune interférence avec l’autofluorescence

eu lieu. En raison de ses avantages sur le bleu fluorescent et

ligands hEP3R légèrement plus sélectifs 4, le 8 marqué au pyryllium semble être le

outil pharmacologique fluorescent le plus qualifié et a été utilisé pour d’autres

études d’imagerie tissulaire.Figure 2Induction de l’expression de hEP3R sur

Cellules HT-29 par média

Retrait. Les cellules HT-29 ont été incubées avec 3 μ M 4, 5 ou 6 après retrait du FBS pendant 72 heures.

h. La liaison non spécifique a augmenté jusqu’à 60%. Cellules HT-29 cultivées avec

Le milieu contenant du FBS a été incubé … Figure 3 Images de fluorescence de 4 sur des cellules HT-29.

(A) A 3 μ M

concentration de 4 a été incubée pendant 1 h sur des cellules HT-29

cultivé sans FBS. Les HEP3R sont détectables dans le cytoplasme.

(B) A 3 μ M concentration de 4 a été incubé pour

1 h sur des cellules HT-29 cultivées … Figure 4 Images de fluorescence de 8 sur des cellules HT-29.

(A) A 300

concentration de nM de 8 a été incubée pendant 1 h sur HT-29

cellules cultivées sans FBS. Les HEP3R sont détectables dans le cytoplasme.

(B) Une concentration de 300 nM de 8 a été incubée pendant 1 h

sur les cellules HT-29 cultivées avec … Les récepteurs EP3 abondent dans les reins.

Hybridation in situ

les expériences ont abouti à une forte expression des récepteurs EP3

dans l’épithélium tubulaire de la médullaire externe et également dans la médullaire

branche ascendante épaisse et conduits collecteurs corticaux et médullaires.25 − 28 Pour la détection de fluorescence de EP3R, 8 était

incubé sur les tissus rénaux de type sauvage (WT) et EP3 – / – souris. Les EP3R ont été détectés en douceur

cellules musculaires des artères rénales et dans les cellules épithéliales du cortex

collecte des tubuli (Figure ​ (Figure5) .5). Pas de signal spécifique

a été observée dans le tissu rénal de la souris knockout EP3. Les récepteurs EP4 sont situés dans les cellules musculaires lisses des artères,

aussi.28 Nous n’avons pas pu détecter de

signal de fluorescence rouge dans le tissu rénal des souris knockout EP3.

Par conséquent, les interactions de la fluorescence 8 marquée au pyryllium rouge avec les récepteurs EP4 dans le tissu murin sous ces

les conditions pourraient être exclues. La distribution des récepteurs EP3

correspond à la régulation médiée par la PGE2 du sodium / eau

réabsorption dans le rein.Figure 5Fluorescence images de 8 sur murin

tissus rénaux.

(A) Une concentration de 1 μ M de 8 a été incubée pour

1 h sur un tissu rénal d’une souris C57Bl6 WT. EP3Rs en douceur

les cellules musculaires des artères rénales sont colorées. (B) A 1 μ M concentration

de 8 était … Le récepteur EP3 est également présent dans

le cerveau avec un

distribution étendue. L’ARNm EP3 est exprimé dans les neurones

du cortex, de l’hippocampe, du thalamus, de l’hypothalamus, du mésencéphale et

Les récepteurs HEP4 sont situés dans les noyaux hypothalamiques30. Pour démontrer la présence de hEP3R dans le cerveau, le 8 marqué au pyryllium a été incubé sur le tronc cérébral inférieur.

tissus cérébraux humains du cortex cérébral et globus pallidus où

aucun récepteur hEP4 n’est localisé. Dans les deux segments du cerveau,

hEP3Rs pourrait être détecté par des signaux de fluorescence rouge après

incubation avec le ligand hEP3R marqué au pyryllium 8. Le ligand de marquage fluorescent rouge 8 était déplaçable

avec un excès de 100 fois 1 (figure ​ (figure 66). Figure 6: images de fluorescence de 8 sur des tissus cérébraux humains.

Une concentration de 1 μ M de 8 a été incubée pendant 1 h

sur un tissu du cortex cérébral. Les HEP3R sont largement étiquetés.

(B) A 1 μ M concentration de 8 a été incubé pour

1 h sur un tissu de cortex cérébral … Sur la base du rôle prévu des récepteurs EP3

dans l’agrégation plaquettaire et la thrombose, nous avons étudié le marquage hEP3R sur les plaquettes humaines avec le ligand marqué au pyryllium 8. Après localisation de l’antagoniste hEP3R 8 sur les plaquettes, le ligand fluorescent rouge a été déplacé avec 1 (Figure 7) .7). L’application de 8 comme un outil pharmacologique a été prouvée dans un FACS (fluorescence

tri cellulaire activé). Environ 50% des plaquettes pourraient être

détecté comme marqué par fluorescence par 8 (Figure ​ (Figure 8) .8). En raison de la gamme de concentration pour l’incubation,

nous ne pouvions pas exclure exeplicitement l’étiquetage supplémentaire de hEP4R, qui sont situés simultanément sur les plaquettes humaines.Figure 7Fluorescence

images de 8 sur les plaquettes humaines. (A) A

1 μ M concentration de 8 a été incubé pendant 1 h sur

plaquettes fixées sur des lames de chambres de circulation. Forte fluorescence rouge

l’émission était détectable. (B) A 1 μ M concentration de 8 a été incubé … Figure 8FACS test avec PRP préincubé avec 8.

(A) Non traité

Le PRP a été mesuré. (B) PRP non traité ne présente aucun signal de fluorescence

dans le canal de fluorescence rouge. (C) PRP préincubé pendant 10 min avec

5 & ​​# x003bc; M 8. Le nuage de PRP n’est pas modifié par rapport à

à … Pour tester les effets antiplaquettaires de notre roman fluorescent

ligands hEP3R, tous les composés ont été analysés dans une plaquette

agrégation

dosage avec du collagène (0,25 μ g / mL) avec PGE2 (1 μ M) comme décrit précédemment.8 Après préincubation du plasma riche en plaquettes humaines (PRP) avec 100

ligand hEP3R nM, PGE2 et agrégation induite par le collagène

ont été inhibées pendant 40 à 96% (Figure � B) (Figure 99).

de l’agrégation plaquettaire induite par le collagène et la PGE2

après préincubation avec des antagonistes de hEP3R. PRP était préincubé

avec le ligand hEP3R approprié pendant 10 min. Agrégation plaquettaire

a été induite avec 0,25 μ collagène g / mL et 1 μ M … En conclusion, de nouveaux ligands hEP3R étiquetés

via diméthylèneoxy

spacer avec des fragments fluorophores ont été conçus. Toutes les structures synthétisées

possèdent des affinités hEP3R dans la concentration nanomolaire

gamme comme les composés parents 1 et 2.

Tous les ligands de notre série inhibent la PGE2 et induite par le collagène

agrégation plaquettaire de magnitude différente. Optimisation du fluorophore

structures de lipophile, petite molécule, bleu fluorescent cyanoisondole,

et le groupe de réactifs de Sanger, plus acide et polaire, fluorescent vert

Les groupes FITC ont abouti au ligand hEP3R 8 fluorescent rouge marqué au pyryllium, ce qui était excellent et applicable

dans la visualisation des récepteurs par microscopie confocale à balayage laser sur

Cellules HT-29 et rein murin et tissus cérébraux humains. En outre, 8 facilite la détection de hEP3Rs sur les plaquettes humaines.

Le composé 8 est à notre connaissance le premier marqueur fluorescent

ligand hEP3R avec un potentiel comme outil pharmacologique.

D’autres études et recherches optimiseront la sélectivité

les quatre récepteurs EP, en particulier vers hEP3 et hEP4.